化疗性肠炎（CE）是化疗主要剂量限制性不良反应之一,其中CPT-11诱导的化疗性肠炎临床发生率竟高达80%,ESMO临床指南推荐的CE治疗药物疗效欠佳。近年来,肠道缺血性损伤在化疗性肠炎发病机制中的重要作用逐步进入学术视野,但是在动物模型中没有相关直接证据,且缺血性损伤的诱发机制尚不明确,更缺乏有效的临床干预措施。首先,化疗可诱导损伤相关模式分子（DAMPS）的大量释放,后者可诱导TLR-4/p38通路的过度激活,另外TLR-4基因敲除小鼠的组织因子（TF）表达降低,提示TF是TLR-4受体通路的下游分子,而且TF还是化疗致持续性凝血状态及深静脉血栓形成的核心因素。由此提出化疗性肠炎发病机制的科学假说,化疗可通过诱发肠道微环境中的TF的高表达,经外源性凝血途径导致肠道血栓形成及缺血性损伤,最终导致化疗性肠炎的发生。其次,我们试图寻找可有效抑制TF的升高,并缓解化疗性肠炎的治疗策略。既往研究证实,臭氧治疗可激活AMPK,进而上调SCOS3抑制TLR-4/p38通路,且临床已有臭氧治疗化疗性口腔粘膜炎的临床证据,我们推测其极有可能在化疗性肠炎的治疗中获得良好疗效。由此提出臭氧治疗化疗性肠炎机制的科学假说,臭氧治疗通过激活AMPK/SCOS-3抑制TLR-4/p38通路激活导致的TF升高,并由此缓解TF诱导的肠道缺血缺氧性损伤,最终发挥治疗化疗性肠炎的疗效,综上所述,本课题拟研究化疗性肠炎的缺血缺氧性损伤的病理机制,并在此基础上寻找有效的药物靶点及治疗措施,具体研究内容包括以下两部分。第一部分化疗性肠炎发病机制的研究研究目的:研究化疗性肠炎中缺血缺氧性损伤的发病机制,探讨TF诱导的血栓形成在化疗性肠炎发生中的作用,并初步探索化疗导致TF升高的分子机制。研究方法:以CPT-11腹腔注射ICR小鼠来建立化疗性肠炎模型,采用Western blotting、明胶酶谱法、免疫组织化学（IHC）、激光多普勒血流测定仪（LDF）等方法来研究化疗性肠炎缺血缺氧性损伤的发病机制。以RAW264.7细胞作为体外实验研究对象,采用Western blotting、RNA干扰等方法来探讨化疗导致TF升高的分子机制。结果:1.ICR小鼠化疗性肠炎模型的建立:腹腔注射CPT-11能够导致ICR小鼠体重下降、腹泻甚至死亡,可建立起质控稳定的化疗性肠炎模型,是研究化疗性肠炎的病理机制的理想动物模型。2.ICR小鼠化疗性肠炎的肠道缩短及肠道粘膜损伤:ICR小鼠化疗性肠炎大肠长度并不是随着CPT-11给药时间的延长而缩短,而是在给药后第1天明显缩短,第3、5天与第1天相比并没有明显的缩短,但在第7天和第9天出现逐渐加重的肠道缩短。肠道组织切片进行H&E染色,并进行病理评分,肠道粘膜损伤与肠道缩短趋势一致。3.ICR小鼠化疗性肠炎的肠道血栓形成:化疗性肠炎的小鼠肠道粘膜内可见大量红细胞堆积形成的混合性血栓形成,并在小血管内可见红染的纤维蛋白样微血栓形成。4.CPT-11导致ICR小鼠血液及肠道TF的升高并诱导缺氧性损伤:血液中TF、HIF-1α、MMP-9升高的水平与肠道缩短、肠道粘膜损伤CMDI评分的趋势是相似的,表现为双峰状态,两个峰值均分别于第1天和第7天出现,且峰值的最高点均为第7天。5.CPT-11通过激活TLR-4/p38通路导致TF的升高:CPT-11刺激RAW264.7细胞4h可诱导TF的表达增加,8h达高峰。p38抑制剂（SB203580,10μM）和p38 siRNA降低了 CPT-11诱导的p38磷酸化,进而降低了 TF表达。结论:化疗可通过激活TLR-4/p38通路诱导TF的高表达,导致肠道血栓形成,最终形成肠道缺血性损伤,是化疗性肠炎的核心发病机制。第二部分 臭氧治疗化疗性肠炎机制的研究研究目的:研究臭氧治疗化疗性肠炎的疗效及安全性,探讨臭氧抑制化疗诱导的TF升高的分子机制。研究方法:动物实验及细胞实验方法同第一部分。另外本研究采用随机对照临床试验,将山东省千佛山医院肿瘤科治的62例临床诊断为化疗性肠炎的肿瘤患者分为2组:非臭氧治疗组和臭氧治疗组,评估臭氧治疗对化疗性肠炎的疗效。结果:1.臭氧治疗改善CPT-11诱导的ICR小鼠化疗性肠炎:臭氧治疗可有效缓解ICR小鼠化疗性肠炎的体重降低及DAI评分升高,为排除本研究中治疗性臭氧混合气体里空气和氧气对结果的影响,对ICR小鼠腹腔注射空气及氧气,结果不能缓解小鼠的体重下降和DAI评分的升高。2.臭氧治疗改善ICR小鼠的化疗性肠炎中的肠道缩短及粘膜损伤:臭氧治疗小鼠化疗性肠炎的肠道缩短情况均得到改善,且高剂量组（0.6mg/kg）改善最为明显,臭氧治疗还可剂量依赖性缓解肠道粘膜的损伤。3.臭氧治疗改善ICR小鼠化疗性肠炎中TF导致的肠道缺血缺氧性损伤:臭氧显著降低了ICR小鼠肠道和血液中TF及HIF-1α蛋白水平,还显著降低了 ICR小鼠肠道中MMP-9水平,采用LDF检测肠道血流量,结果显示臭氧治疗显著改善了CPT-11诱导的小鼠肠道血流量的降低。4.臭氧治疗改善肿瘤患者的化疗性肠炎:35例非臭氧治疗组9例（42.89%）获得完全缓解,2例（9.52%）获得部分缓解;27例臭氧治疗组9例（60.00%）获得完全缓解,4例（26.67%）获得部分缓解。以完全缓解和部分缓解例数之和来计算有效率,两组存在统计学差异,且臭氧治疗组的有效率更高（非臭氧治疗组vs.臭氧治疗组:86.67%vs.52.38%,P=0.03）。5.臭氧治疗改善肿瘤患者的血液高凝状态:62例化疗性肠炎患者的凝血功能检测结果表明,臭氧治疗组可有效降低了肿瘤患者的D-二聚体及FDP水平,改善了患者的血液高凝状态。6.臭氧通过激活AMPK/SCOS-3抑制CPT-11诱导的TF高表达:ICR小鼠予以腹腔注射高剂量臭氧后1小时内显著增加p-AMPK和SCOS3表达。经不同剂量臭氧预处理的RAW 264.7细胞再给予CPT-11,结果显示臭氧可剂量依赖性的降低TF的表达,并可有效升高p-AMPK和SCOS3的表达。AMPK抑制剂（激活剂）可消除（模拟）臭氧对p-AMPK、SCOS3、p-p38和TF表达的影响,结论:我们的数据表明,臭氧治疗可激活AMPK/SCOC-3抑制化疗通过TLR-4/p38通路激活导致的TF升高,进而缓解化疗性肠炎的缺血缺氧性损伤,并有效治疗化疗性肠炎。研究的创新点1、本研究首次证实,TF在化疗性肠炎发病机制中的核心作用。化疗可通过激活TLR-4/p38通路诱导TF的高表达,后者经外源性凝血途径导致肠道血栓形成和缺血缺氧性损伤,最终致化疗性肠炎的发病。2、本研究首次证实,“二次打击”损伤可能是化疗性肠炎的重要病理机制。小鼠血液（而不是肠道）中的TF、HIF-1α和MMP-9的“双峰”水平与肠道粘膜的“二次损伤”趋势一致,表明TF诱导血栓形成致肠道微环境的缺血缺氧才是触发化疗性肠炎核心的病理机制。3、本研究首次发现并报道了臭氧可用于治疗CPT-11诱导的化疗性肠炎。臭氧治疗可通过激活AMPK/SCOC-3抑制化疗诱导TLR-4/p38通路激活导致的TF升高,进而缓解化疗性肠炎的缺血缺氧性损伤,发挥缓解化疗性肠炎的效应。