论文部分内容阅读
1研究目的通过收集临床数据资料进行挖掘分析,健脾化湿通络法治疗类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)贫血患者的用药规律,探讨RA贫血患者红细胞参数的变化及与实验室指标的关联规则。通过构建随机行走模型来评价健脾单元疗法改善RA贫血患者免疫炎症指标的情况。通过临床研究,研究患者贫血指标、免疫炎症指标与铁代谢指标、相关细胞因子、Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路指标的相关性,探究RA贫血发生的初步机制。通过体外细胞实验,研究健脾化湿通络方-新风胶囊,治疗RA贫血的生物学机制。2研究方法2.1数据挖掘研究1)筛选安徽省中医院风湿免疫科2012年6月-2018年1月RA贫血住院患者的病历资料及口服中药资料。分析患者实验室指标的变化及处方涉及中药的性味归经情况,探索治疗RA贫血处方的用药规律。为研究健脾化湿通络中药与实验室检查指标变化之间的关系,运用SPSS Clementine 11.0软件中Apriori模块对中药与红细胞参数、免疫炎症指标的关系进行关联规则分析。2)健脾单元疗法是治疗RA贫血的特色治疗模式,即“内服中药、新风胶囊+外敷芙蓉膏”治疗模式。为研究其治疗效果,在使用中药的RA贫血患者中,设为实验组(内服中药、新风胶囊+外敷芙蓉膏)和对照组(单纯内服中药),运用复杂网络技术分析两组中药的核心处方,并比较两组实验室指标的变化,探究中药与指标改善的关联性。采用随机行走模型对两组RA贫血患者的红细胞(Red blood cell,RBC)计数、血红蛋白(Hemoglobin,Hb)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)进行评价。2.2临床研究依据纳入及排除标准,将39例RA贫血患者设为研究组,36名正常健康人设为对照组,分析两组贫血指标、铁代谢、免疫炎症指标的变化,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法、免疫比浊法等检测相关细胞因子、JAK2/STAT3信号通路指标。对研究组患者的贫血指标、免疫炎症指标与铁调素(Hepcidin,Hepc)、铁代谢指标、细胞因子、JAK2/STAT3信号通路指标进行相关性分析。2.3基础实验研究选取24例RA贫血患者和6例健康人,每人收抽取外周血5ml,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。实验分为5组:Ⅰ组(正常组:健康受试者的PBMCs),Ⅱ组(模型组:RA贫血患者的PBMCs),Ⅲ组(XFC组:含有最佳浓度XFC的RA贫血患者的PBMCs),Ⅳ组(AG490组:AG490干预RA贫血患者PBMCs),V组(AG490+XFC组:含有最佳浓度的XFC、AG490干预RA贫血患者PBMCs)。采用MTT法检测XFC对于患者PBMCs的增殖影响。免疫荧光(Immunofluorescence,IF)法检测XFC对JAK2、STAT3、Hepcidin表达的影响;ELISA法检测XFC对IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、Hepcidin表达的影响;实时定量PCR(RT-q PCR)法检测XFC对JAK2/STAT3/Hepcidin-m RNA表达的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)法检测XFC对JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达的影响。3结果3.1数据挖掘研究3.1.1通过关联规则探究中药改善RA贫血患者的用药规律研究纳入RA患者4818例,其中RA贫血患者2612例,占RA总数的54.21%。其中男性494例,女性2118例,男女比例为1:4.29,年龄(52.39±11.09)岁,住院时间(17.43±10.76)日。与治疗前相比,治疗后患者的贫血指标:RBC、Hb、平均红细胞体积(Mean corpuscular volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(Mean corpuscular hemoglobin,MCH)均升高(P<0.01),平均红细胞血红蛋白浓度(Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)降低(P<0.01)。与治疗前相比,炎症指标ESR、CRP及免疫指标:补体C3(Complement 3,C3)、补体C4(Complement 4,C4)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)、免疫球蛋白A(Ig A)、类风湿因子(Rheumatoid factor,RF)均降低(P<0.01),免疫球蛋白G(Ig G)升高(P<0.01)。免疫球蛋白M(Ig M)治疗后虽下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。研究共涉及12873张处方329味中药,所用中药涉及寒、热、温、凉、平共5性,其中,寒性、温性、平性药运用最为频繁,出现率均在24%以上,使用频率均在92%以上;所用中药涉及酸、苦、甘、辛、咸、涩、淡共7味,其中味苦、味甘、味辛药运用最为频繁,出现频率均在38%以上,使用频率均在98%以上;处方中药涉及肺经、大肠经、胃经、脾经、心经等12经,在药物归经中,肝、肺、胃、脾、肾、心经出现频率均在22%以上,使用频率均在96%以上;处方中药主要由以下五类药物为主:健脾化湿药、清热解毒药、活血化瘀药、祛风湿通络药、益气养血药。前项为1关联分析中,关联的支持度、置信度、提升度均较高的有丹参与RF的下降(支持度85.91%,置信度86.28%,提升度1.01);茯苓与ESR的下降(支持度91.65%,置信度98.04%,提升度1.04)。前项为2关联分析中,红花&茯苓与RF的降低(支持度、置信度、提升度分别为76.99%、86.37%、1.02);陈皮&茯苓与ESR的降低(支持度、置信度、提升度分别为81.05%、83.36%、1.03)。3.1.2随机行走模型分析中医健脾单元疗法改善RA贫血免疫炎症指标情况共计1251例RA贫血患者符合研究要求,依据是否使用新风胶囊(Xinfeng Capsule,XFC)内服和芙蓉膏(Furong Ointment)外敷,分为对照组与实验组;对照组仅使用中药内服,实验组使用中药内服、XFC内服、芙蓉膏外敷。对照组754例,其中男性161例,女性693例,年龄18~88岁,平均(55.45±13.91)岁;实验组497例,其中男性109例,女性388例,年龄29~87岁,平均(56.61±13.32)岁。两组RA贫血患者在年龄、性别方面比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与本组治疗前相比,两组治疗后RBC、Hb水平均上升(P<0.05或P<0.01),CRP、ESR、Ig A、Ig G、RF、anti-CCP、C3、C4水平均下降(P<0.05或P<0.01)。两组患者治疗后IGM与治疗前相比,差异无统计学意义(P>0.05)。两组治疗前后的差值相比较,实验组在升高RBC、Hb,降低CRP、ESR、anti-CCP方面优于对照组(P<0.01)。两组在Ig A、Ig G、Ig M、RF、C3、C4比较方面,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组的RBC、Hb、CRP、ESR综合评价的正向递增率分别为0.1321、0.2781、0.1545、0.4286,每正向行走1步综合改善率分别为23.78%、27.81%、52.19%、22.11%。实验组RBC、Hb、CRP、ESR综合评价的正向递增率分别为0.2178、0.2781、0.6012、0.4901,每正向行走1步综合改善率分别为37.63%、39.39%、33.89%,29.01%。3.2临床研究3.2.1研究对象一般情况39例RA贫血患者设为研究组,男性9例,女性30例,平均(56.03±13.47)岁。36名正常健康人设为对照组,男性9例,女27例,平均(57.97±9.16)岁。两组基线在年龄、性别方面比较(P>0.05),两组具有可比性。3.2.2两组血常规指标、铁代谢、免疫炎症指标的变化与对照组相比,RA贫血患者RBC、Hb、血清铁(Serum iron,SI)、总铁结合力(Total Iron binding capacity,TIBC)显著降低(P<0.01),而转铁蛋白(Transferrin,TRF)、Hepcidin水平显著升高(P<0.01);研究组患者CRP、ESR、RF、IGA、anti-CCP水平显著升高(P<0.05或P<0.01);两组Ig G、Ig M指标比较无统计学意义(P>0.05);与对照相比,研究组患者IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3水平显著升高(P<0.01),IL-4、IL-10水平显著降低(P<0.01)。3.2.3 RA贫血患者贫血指标、免疫炎症指标与铁代谢、信号通路及细胞因子指标的相关性分析贫血指标与铁代谢、信号通路及细胞因子指标的相关性分析显示:RBC水平与Hepcidin呈负相关(P<0.05),与JAK2呈负相关(P<0.01),与SI呈负相关(P<0.01),与其他指标无相关性(P>0.05)。患者Hb水平与Hepcidin呈正相关(P<0.05),与IL-6呈正相关(P<0.05),与SI呈正相关(P<0.01),与其他指标无相关性(P>0.05)。炎症指标与铁代谢、通路指标、细胞因子的相关性分析显示:ESR水平与He-pcidin呈正相关(P<0.01),与IL-10呈正相关(P<0.05),与其他指标无相关性(P>0.05)。患者CRP水平与TRF、SI呈负相关(P<0.05或P<0.01),与其他指标无相关性(P>0.05)。免疫指标与铁代谢、JAK2/STAT3通路指标、细胞因子的相关性分析,结果显示:患者Ig A水平与IL-6呈正相关(P<0.05),与IL-10呈正相关(P<0.05),与其他指标无相关性(P>0.05);患者RF水平与IL-6、SI呈正相关(P<0.05),与TNF-α成负相关(P<0.01),与其他指标无相关性(P>0.05)。3.3基础实验研究3.3.1 MTT法检测XFC对RA贫血患者PBMCs的影响与同期阴性对照组相比,低、中、高剂量XFC组OD下降,各剂量组XFC对PBMCs的抑制作用随着作用时间的延长,对细胞的抑制率逐渐增强;中剂量组XFC在作用24h时RA贫血患者抑制率接近50%。故本次试验中剂量XFC为最佳作用浓度,24h为最佳作用时间。3.3.2 ELISA法检测XFC对RA贫血患者PBMCs的IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、Hepcidin的影响正常组相比,模型组IL-6、TNF-α、Hepcidin升高(P<0.01),IL-4、IL-10降低(P<0.01);与模型组相比,经药物干预后各组IL-6、TNF-α、Hepcidin降低(P<0.01),IL-4、IL-10升高(P<0.01);与XFC组相比,AG490组IL-6、TNF-α、Hepcidin降低(P<0.01),IL-4、IL-10升高(P<0.01或P<0.05);与AG490组相比,AG490+XFC组IL-6、TNF-α、Hepcidin降低(P<0.01),IL-4、IL-10升高(P<0.01)。3.3.3 RT-q PCR法检测XFC对RA贫血患者PBMCs的JAK2/STAT3/Hepcidin-m RNA的影响与正常组相比,模型组JAK2m RNA、STAT3m RNA、Hepcidin-m RNA均升高(P<0.01);与模型组相比,给予药物干预后各组JAK2m RNA、STAT3m RNA、Hepcidin-m RNA均降低(P<0.01);与XFC组相比,AG490组JAK2m RNA、STAT3m RNA、Hepcidin-m RNA均降低(P<0.01);与AG490组相比,AG490+XFC组JAK2m RNA、STAT3m RNA、Hepcidin-m RNA降低(P<0.01)。3.3.4免疫荧光法检测XFC对RA贫血患者PBMCs的JAK2、STAT3、Hepcidin影响JAK2、STAT3、Hepcidin标记的细胞核、细胞质阳性表达时呈现红色荧光。与正常组相比,模型组荧光强度明显增强(P<0.01);与模型组相比,经药物干预后各组的荧光强度均减弱(P<0.01)。与XFC组相比,AG490组红色荧光细胞比例减少,强度减弱(P<0.01)。与AG490组相比,AG490+XFC组红色荧光表达减少,强度减弱(P<0.01或P<0.05)。AG490+XFC组呈现红色荧光细胞比例,在RA贫血PBMCs中数量最少、强度最弱。3.3.5 Western blot法检测XFC对RA贫血患者PBMCs的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的影响与正常组相比,模型组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白均升高(P<0.01);与模型组相比,给予药物干预后各组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3均降低(P<0.01);与XFC组相比,AG490组JAK2、p-STAT3均降低(P<0.01),p-JAK2、STAT3虽降低,差异无统计学意义(P﹥0.05)。与AG490组相比,AG490+XFC组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3降低(P<0.01)。4结论4.1我院风湿科治疗RA贫血主要有以下5类药物:健脾化湿药、清热解毒药、活血化瘀药、祛风湿通络药、益气养血药,以健脾化湿药为核心。健脾化湿药的使用与患者免疫炎症指标的改善具有强关联。4.2“健脾单元疗法”治疗模式与患者综合评价指标存在长程关联,使用单元疗法治疗的患者RBC、Hb、ESR、CRP的综合评价指标改善均优于单纯中药内服,反映该治疗模式在改善贫血、降低免疫炎症的确切作用。4.3 RA贫血患者铁代谢、JAK2/STAT3信号通路、免疫炎症指标与正常健康患者之间存在明显差异。RA贫血患者体内高水平的免疫炎症反应与铁代谢紊乱、细胞因子失衡、Hepcidin相关JAK2/STAT3信号通路的异常活化直接相关。4.4 XFC能够治疗RA贫血,其作用机制包括:(1)通过下调促炎因子IL-6、TNF-α,上调抑炎因子IL-4、IL-10,调节JAK2/STAT3信号通路,改善患者免疫炎症反应。(2)XFC具有类AG490阻断剂样作用,通过下调IL-6的水平,抑制总JAK2蛋白的表达,降低p-JAK2的活性,进一步下调STAT3、p-STAT3的水平,使与Hepcidin基因启动子结合的p-STAT3数量减少,最终导致Hepcidin合成减少,从而治疗RA贫血。