中国白酒历史悠久,属世界上六大知名蒸馏酒之一。白酒酿造过程中,众多微生物发挥了作用,是白酒品质的决定性因素。基因测序等技术的进步,推动了白酒酿造微生物全局性的研究。创办于1817年的枝江大曲是长江中游浓香型白酒的典型代表,具有200多年酿造历史,这一地理气候特征下的酿酒微生物,具有重要研究价值。本研究以枝江白酒为对象,系统研究了白酒发酵相关微生物的活菌组成、动态变化规律,及其与白酒品质的关系;同时,分析了酿酒系统中死菌的存在对大曲、窖泥及酒醅中微生物群落的影响,解答了对过往研究没有区分酿酒系统中的死菌和活菌,死菌干扰可能带来研究结果和认识上失真的疑问。主要研究结果如下:1.来自新、老窖池的浓香型原酒的香味物质成分存在明显差异。以5年和20年窖池所产的浓香型原酒为研究对象,采用气相色谱和离子色谱分析结合多元统计来表征白酒中的差异性香味物质,并通过雷达图评价其感官质量。总计筛选出30种差异性香味物质。相比新窖池,老窖池所产的白酒中己酸乙酯含量更高,乙醛和乙缩醛含量更低,其辛辣感和刺激性更弱,醇厚度和爽净感都更好,因而感官质量更佳。2.浓香型白酒大曲、窖泥、酒醅中存在死菌细胞。叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)可用于除去死菌。使用PMA结合q PCR的手段发现:(1)大曲中死细菌极少,死真菌较多,占总真菌数的71.3%。(2)5年和20年窖泥中存在大量的死细菌细胞,分别占总细菌的50.8%和71.8%;20年窖泥的总细菌、活菌均比5年窖泥高。(3)发酵7天时,两种酒醅中死细菌较多,均占总细菌数的约50%,而发酵15天,30天和60天时,死细菌极少;整个发酵过程酒醅中死真菌均极少;活细菌和活真菌均在发酵30天时达到峰值。3、浓香型白酒大曲、窖泥、酒醅微生物群落多样性及结构不受死菌细胞影响,其中酒醅活菌微生物群落多样性及结构随发酵时间变化。使用PMA结合扩增子测序分析大曲、5年和20年的窖泥、5年和20年的窖池内酒醅的微生物群落多样性及结构发现:大曲细菌和真菌的多样性及结构均不受死菌细胞的影响;两种窖泥的细菌群落多样性及结构不受死细菌的影响,但受窖池年龄影响;两种酒醅的细菌和真菌多样性及结构均不受死菌细胞的影响。发酵过程中,两种酒醅的活细菌的多样性整体均呈下降趋势;发酵7天的和发酵15天的酒醅活细菌结构之间存在显著不同,而发酵30天的和发酵60天的酒醅活细菌结构之间差异不显著。5年窖池内酒醅中活真菌多样性整体较稳定,而20年窖池内酒醅中活真菌的多样性波动较大。5年窖池酒醅真菌结构整个发酵过程中相对稳定,而20年窖池酒醅活真菌结构在发酵30天后才趋于稳定。4、大曲、窖泥和酒醅的活菌群落组成各不相同,且来源于环境的细菌对酒醅的影响最大。使用PMA结合扩增子测序,分析了大曲、窖泥和酒醅的活菌组成,主要发现如下。(1)大曲中占优势地位的细菌的属主要有Bacillus(16.6%)和Kroppenstedtia(15.1%)等16个;高丰度的真菌主要有Aspergillus(40.7%),Thermoascus(24.6%)和Thermomyces(11%)等8个属。(2)窖泥中共存在18个优势细菌属。新老窖泥的细菌组成存在明显差异,5年窖泥中来自Lactobacillaceae科的未知分类地位的新属和Lactobacillus最丰富,占总丰度的81.6%。20年窖泥中,除Lactobacillus外,Clostridium和Caproiciproducens丰度最高,分别为11.9%和12.8%。(3)酒醅中,属一级分类地位的占优势地位的细菌和真菌分别为35个和9个。发酵0到15天,占主导的活细菌种有Lactobacillus(8.0%-70.9%),Pseudomonas(2.3%-7.7%),Bacillus(1.2%-17.1%),Acetobacter(0.002%-12.52%)等。发酵30天以后,窖池内酒醅的细菌基本上以Lactobacillus(83%-92%)为主。就真菌而言,整个发酵过程基本以Saccharomyces(40,7%-80.7%)为主。使用Source tracker软件对酒醅微生物进行溯源分析,结果表明来源于环境的细菌对酒醅的影响最大,大曲和窖泥次之。窖泥细菌对老窖池酒醅影响大而对新窖池影响相对较小。酒醅中的芽孢杆菌主要来源于大曲和环境,乳酸菌则主要来源于窖泥。5、新老窖池酒醅细菌单菌基因组以乳酸菌为主,其关键基因随发酵时间呈现不同的变化趋势。通过深度宏基因组测序,利用宏基因组组装和Binning技术,从5年和20年窖池酒醅中共获得161个非冗余的细菌单菌基因组,占主导的属(平均相对丰度>1%)有19个,其中Lactobacillus最丰富。基于微生物组学的功能分析发现,产生乙醇、丁酸、己酸的关键基因在发酵前期具有较高的相对丰度,而发酵后期相对丰度则较低。5年窖池酒醅中,产生乙酸和乳酸的关键基因在整个发酵过程中都占有较高的比例,但在20年窖池酒醅中,它们在发酵前期相对丰度较高,后期相对丰度低。同时还发现,发酵前期,乳酸菌以抗酸基因(arg R,asp A,ilv E,cfa)实现抗酸功能,而在发酵后期则主要以Dna K基因来实现抗酸功能。本研究评估了死菌细胞对浓香型白酒发酵相关微生物群落结构估计的影响,详细描述基于活菌的群落特征,并在此基础上剖析了酒醅微生物来源,定量分析酒醅细菌同大曲细菌、窖泥细菌之间的关系,有利于更加准确地刻画和理解白酒微生物群落。同时,从基因层面揭示了浓香型白酒发酵过程中白酒微生物产香关键基因的变化规律和乳酸菌耐酸机理,有助于深化人们对白酒微生物产香功能和乳酸菌耐酸功能的认识,对提高白酒品质具有较强的指导意义。