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研究背景:心血管疾病是一种严重威胁人类健康的疾病,其中高血压是心血管病的主要危险要素,持久性高血压可使动脉血管壁增厚或变硬,进而可引起心室肥厚,心肌收缩功能减退,最终发生心力衰竭。唾液酸转移酶7A（Sialyltransferase7A,Siat7A）是CMPNeu5Ac:Gal NAc-Rα2,6-唾液酸转移酶,有学者在不同基因背景的高血压大鼠的肥厚心肌组织中筛选近两万种基因,其中Siat7A表达量出现唯一持续性增加。转化生长因子激活激酶1（TGF-βactivetedkinase1,TAK1）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）中的一员。成年小鼠行主动脉弓结扎（TAC）,其心肌组织中的TAK1活性在TAC后第7天发生上调。在小鼠心肌中过表达TAK1后,TAK1通过激活p38通路促进胚胎基因表达,从而导致心肌肥厚甚至间质纤维化,最终导致心肌功能发生障碍。Kruppel like factor4（Klf4）作为KLF家族的一员,在小鼠肥厚心肌和培养的肥厚心肌细胞中表达上调。本课题组已经研究证实,缺氧条件下,人源心室肌细胞系AC16细胞内Klf4表达增加,并通过反式激活Siat7A启动子区域,增加Siat7A表达,进而增加Siat7A的底物抗原sialyl-Tn（Neu5Acα2–6Gal NAc-O-Ser/Thr）的生成。然而在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激而致的肥厚心肌细胞中唾液酸化程度增加,同时缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）的表达上调。HIF-1a通过结合TAK1启动子1285-1274bp区域,启动TAK1基因的转录,活性增加的TAK1可激活核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路,导致心肌发生肥厚。研究目的:基于以上研究结果,本研究期待解决的问题如下:（1）在AngⅡ诱导的肥厚心肌中,Klf4的表达是否发生变化?（2）在AngⅡ诱导的肥厚心肌中,Klf4的表达变化是否影响Siat7A的表达?（3）在高血压心肌肥厚中,Siat7A、TAK1与Klf4三者是否存在相互作用关系?通过研究以上问题,希望能够为高血压心肌肥厚的临床治疗方面提供新思路,为预防高血压心肌肥厚找到新靶点。材料方法:从尸检标本中搜集心肌肥厚患者心肌组织,以及无任何心脏疾病背景患者的心肌组织,制备组织切片;选取之前制备成功的高血压合并心肌肥厚的大鼠心脏组织,切取石蜡切片,通过行苏木精-伊红染色观察心肌组织病理性改变;通过行免疫组化染色检测当心肌肥厚发生时Siat7A、TAK1与Klf4在心肌细胞中的表达情况。培养人源心室肌细胞系AC16细胞,并分别使用携带敲低Siat7A基因的质粒慢病毒或过表达Siat7A基因的质粒慢病毒转染细胞,筛选出稳定敲低或过表达Siat7A基因的细胞系;给予AngⅡ（1μM）刺激24h后,收集蛋白和m RNA样品。采用Western Blot检测心房钠尿肽（Atrial Natriuretic Peptide,ANP）、α辅肌动蛋白（α-actinin）、Siat7A、TAK1以及Klf4蛋白水平的表达;采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）检测ANP、脑钠肽（Brain Natriuretic Peptide,BNP）、β肌凝蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）、Siat7A、TAK1以及Klf4在m RNA水平的表达。为了进一步明确Siat7A、TAK1以及Klf4三者在心肌细胞发生肥厚过程中的先后作用关系,我们使用一定浓度AngⅡ（1μM）对AC16细胞分别施以0.5h,1.5h,3h,6h,12h的刺激,然后收集样品,检测刺激持续不同时间段的Siat7A、TAK1、Klf4以及心肌肥厚标志因子的表达。实验结果:无论是原发性高血压患者的心肌组织,还是AngⅡ诱导的高血压大鼠的肥厚心肌组织中,Siat7A、TAK1和Klf4的蛋白表达量均平行增加;在体外实验,不同浓度AngⅡ（0μM、0.1μM、1μM）刺激AC16细胞24h后,ANP、β-MHC、α-actinin和Siat7A、TAK1、Klf4的表达量随AngⅡ浓度的增加而升高;携带敲低Siat7A的质粒慢病毒侵染AC16细胞后,Siat7A表达明显减少;当使用AngⅡ（0μM、1μM）刺激低表达Siat7A的细胞后,TAK1、Klf4以及ANP、BNP、β-MHC、α-actinin的表达量也随之减少;携带过表达Siat7A基因的质粒慢病毒侵染AC16细胞后,细胞中Siat7A呈现过表达,当使用AngⅡ（0μM、1μM）刺激过表达Siat7A的细胞后,TAK1、Klf4以及ANP、BNP、β-MHC、α-actinin的表达量也随之增加。使用si RNA在AC16细胞中敲低TAK1后,细胞中TAK1表达明显减少,同时给予AngⅡ刺激后,Siat7A、Klf4以及ANP、BNP、β-MHC、α-actinin也随之减少。使用si RNA在AC16细胞中敲低Klf4后,细胞中Klf4表达明显减少,再施以AngⅡ刺激,Siat7A、TAK1以及ANP、BNP、β-MHC、α-actinin也随之表达减少。使用AngⅡ刺激AC16细胞持续不同时间结果显示,Klf4蛋白于AngⅡ刺激0.5h时开始表达增加,Siat7A蛋白于AngⅡ刺激1.5h时开始表达增加,TAK1蛋白于AngⅡ刺激3h时开始表达增加,α-actinin和ANP蛋白分别于AngⅡ刺激1.5h及3h开始表达增加。实验结论:1.在高血压患者的肥厚心肌组织中,Siat7A、TAK1与Klf4三者蛋白表达量平行升高。2.AngⅡ刺激诱发大鼠发生高血压合并发生心肌肥厚的心肌组织中Siat7A、TAK1与Klf4三者蛋白表达量均平行增加。在体外实验,施加一定浓度AngⅡ一定时间可诱导AC16细胞发生肥厚,Siat7A、TAK1与Klf4三者表达量均增加。3.在AngⅡ诱导的心肌肥厚发生发展过程中,Klf4可能最早被启动表达,继而增加Siat7A的表达,随之上调TAK1的表达。Siat7A、TAK1与Klf4三者在肥厚心肌中相互促进,并以形成闭合环路的方式共同促进心肌肥厚的发生发展。