新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒感染引起禽类的一种高度接触性、烈性传染病,是造成养禽业重大经济损失的主要疫病之一。到目前为止,疫苗免疫接种仍是我国防控ND的主要手段。基因Ⅲ型NDV疫苗株Mukteswar(Ⅰ系苗)在我国得到了广泛使用,由于Mukteswar株的毒力较强,属于中等毒力NDV,使用过程中可能会造成疫苗株毒力增强而引发新的危险。近年来,有研究报道称临床上分离到的基因Ⅲ型NDV与Mukteswar株有很高的相似性,但分离株的毒力明显强于Mukteswar株,表明疫苗株在临床上已出现了毒力的返强。本实验室在2005年分离到一株NDV强毒株JS/7/05/Ch,其与Mukteswar株基因组序列高度同源,因此,本文以这两株基因Ⅲ型NDV为研究模型,系统比较了两病毒对鸡的致病性差异,并在此基础上对Mukteswar株毒力增强的分子机制进行了研究。1.两株不同毒力的基因Ⅲ型新城疫病毒致病性比较通过评估两株不同毒力的基因Ⅲ型NDV JS/7/05/Ch株和Mukteswar株在感染4周龄SPF鸡后的脾脏、法氏囊、胸腺和肺脏中病毒的复制能力,以及免疫相关细胞因子的表达情况。发现感染后第4天,JS/7/05/Ch在组织器官中的病毒含量均高于Mukteswar株,其中两者在脾脏和法氏囊中的含量存在明显差异。感染后24h, JS/7/05/Ch能够诱导过激的干扰素表达,干扰素表达水平的能力显著高于Mukteswar株。JS/7/05/Ch和Mukteswar诱导的宿主免疫应答的差异主要表现前者可诱导组织中多个炎性反应相关基因表达量的上调,且基因的表达水平显著高于Mukteswar调控的基因,其中在感染后12h, JS/7/05/Ch诱导脾脏中IL-6的表达量显著高于Mukteswar感染组,说明JS/7/05/Ch能够诱发宿主更强烈的机体炎症反应。研究结果表明,与Mukteswar相比,JS/7/05/Ch在机体内的高效复制及其诱导的促炎性细胞因子早期的大量表达,是造成机体严重损伤的主要原因。2.基因111型新城疫病毒Mukteswar毒力增强的分子基础前期研究中通过HN基因的互换已经证实该基因是Mukteswar毒力增强的主要原因,为了进一步分析HN基因上决定病毒毒力增强的功能结构域和关键位点,我们以Mukteswar株为骨架,结合基因比对分析结果,对位于HN蛋白上受体结合区域的差异位点(494,495位)进行了突变,获得了突变质粒TVT-MukHN494+495JS,该质粒与辅助质粒共转染BSR细胞后,成功拯救出突变病毒,命名为MukHN494+495JS。我们对突变病毒的复制能力,致病性以及感染后诱导宿主免疫应答的差异进行分析,发现突变病毒MukHN494+495JS的致病性明显高于母本病毒Mukteswar,且生物学特性及诱导宿主炎性细胞因子的表达能力与JS/7/05/Ch接近,并明显高于母本病毒Mukteswar.研究结果表明,HN蛋白的第494,495位氨基酸在病毒毒力、病毒高效复制效率以及病毒诱导强烈炎症应答方面起重要作用,可能是决定疫苗株Mukteswar毒力增强的关键位点。