论文部分内容阅读
目的:探讨microRNA-10a在宫颈癌组织和血清样本中的表达与淋巴转移的相关性,及体外实验检测其对宫颈癌细胞侵袭、迁移和增殖能力及顺铂耐药性的影响,明确靶基因并对其机制进行初步探索,以期探讨miR-10a在宫颈癌中的应用前景。 方法:应用Real time PCR方法检测42例宫颈癌组织样本及31例宫颈癌血清中miR-10a的表达水平,分析miR-10a表达与淋巴转移的相关性。利用脂质体lipofectamine2000将成熟miR-10a模拟物、阻遏物及相应阴性对照(NC)转染Hela和Siha细胞;用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞术分别检测miR-10a对细胞增殖的影响及对顺铂耐药性的影响。Transwell及划痕实验证实miR-10a对细胞侵袭迁移的影响;双荧光素酶报告基因实验证实PTEN为miR-10a的靶基因;Real time PCR及蛋白印迹法分别检测转染miR-10a对PTEN基因mRNA和蛋白水平的影响。免疫荧光检测过表达miR-10a对β-catenin蛋白细胞内表位的影响。 结果:有淋巴转移的宫颈癌组织标本中miR-10a表达量是无转移组织样本中表达量的3.1倍,差异有统计学意义。血清中miR-10a表达量与淋巴转移无相关性,配对的10例宫颈癌组织标本与血清miR-10a的表达无相关性。转染效率在48h最高,miR-10amimic上调miR-10a表达1328倍,miR-10ainhibitor下调miR-10a表达98%。MTT结果提示miR-10a在72h内对细胞增殖无明显影响。上调miR-10a组Hela细胞顺铂半数抑制浓度(IC50)为7.2μg·ml-1,与NC组(IC50为5.6μg·ml-1)比较差异有统计学意义;上调miR-10a组Siha细胞顺铂IC50为6.4μg·ml-1,与NC组(IC50为3.8μg·ml-1)比较差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞分析显示,上调miR-10a后Hela细胞凋亡率降低(8.39±1.25)%,与NC组(14.65±2.23)%比较差异有统计学意义,上调miR-10a后Siha细胞凋亡率降低(39.34±2.38)%,与NC组(49.25±2.46)%比较差异有统计学意义(P<0.05),Transwell及划痕实验证实miR-10amimic可增加Hela及Siha侵袭迁移细胞数目,差异有统计学意义;双荧光素酶报告基因实验证实miR-10a通过作用于PTEN基因3’-UTR区在转录水平上干扰其表达;上调miR-10a致使靶基因PTEN蛋白水平表达降低而基因水平无明显影响。免疫荧光结果提示miR-10amimic可促进β-catenin向细胞核聚集。miR-10a可能是通过活化PTEN/PI3K/AKT/WNT信号通路从而促进宫颈癌细胞转移及耐药的发生。 结论:1、MiR-10a可促进宫颈癌Hela及Siha细胞的侵袭迁移能力及增强其对DDP的耐药性。2、MiR-10a在转录水平抑制靶基因PTEN蛋白表达。3、MiR-10a在宫颈癌组织中高表达与淋巴转移呈正相关,在组织与血清中的表达无相关性。4、MiR-10a促进宫颈癌细胞侵袭迁移及耐药性的机制可能是通过抑制PTEN蛋白表达,从而促进β-catenin向胞核聚集,其具体信号通路有待进一步的探讨和研究。