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P450 BM-3是从巨大芽孢杆菌中发现的具有脂肪酸羟基化活性的酶,它具有快速催化链长为C12-C22的饱和脂肪酸的单加氧酶活性,在生命活动、药物合成以及其它生物催化与转化过程中有重要的研究意义,但很多的研究表明,该酶存在稳定性差、对非天然底物催化效率低等一些缺陷,已经严重阻碍其发挥应有的功能和作用。目前,国外已有研究者正通过各种途径期望提高该酶的稳定性和催化活性,但由于对该酶蛋白结构和功能信息研究的缺乏,尚未获得令人满意的结果。 目前定向进化技术在改变酶功能特性和构建具有新的功能特性的酶中显示出巨大的潜力,比如P450BM-3(A74G,F87V,L188Q)突变体能够催化吲哚生成靛蓝,这是野生型P450 BM-3所不具有的催化功能。我们通过进一步的定向进化技术已经成功获得了三个具有更高活力的催化吲哚的突变酶P450 BM-3(139V;D168N,A225V,K440N;E435D)。为了进一步的研究这些突变酶底物专一性的变化情况,利用突变酶对一系列的苯系化合物进行生物催化,发现这些突变酶都能催化苯乙烯生成环氧苯乙烷再进一步水解为苯乙二醇,通过筛选确定了突变酶HML003对苯乙烯的催化活力最大。同时由于P450 BM-3在催化过程中需要辅助因子,因此我们利用全细胞生物转化法系统研究了反应时间,反应体系,温度,底物浓度,助溶剂DMSO,葡萄糖,补料法对P450 BM-3突变酶催化苯乙烯最终生成苯乙二醇的影响。确定了最佳的全细胞生物转化条件,作后对可能的催化机理进行了分析,该单加氧酶通过空气中的分子氧源生成环氧苯乙烷,由于环氧苯乙烷的三元环变易性很大易发生开环反应,在弱酸弱碱性条件下很容易生成反式的苯乙二醇,而在单加氧酶的酶促反应中由于有辅酶Ⅱ的参与体系呈弱碱性,故有水解反应的合适条件,最终生成苯乙二醇且产物在胞外累积,便于提取。