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胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是颅内最常见的恶性肿瘤。由于GBM具有生长速度快、肿瘤异质性、放化疗抵抗的特性使其难以根治。术后放疗联合同步和辅助替莫唑胺(TMZ)化疗已成为其标准治疗方式,但其5年生存率不到10%且中位生存期也不到15个月。目前对GBM的研究越来越多的集中在分子生物学机制研究,以期找到能够治疗GBM的新靶点。microRNAs(miRNAs)是一类非编码的小分子单链RNA,近年来研究证明,miRNAs表达水平的异常与GBM的发生发展和放化疗抵抗有关。自噬(Autophagy),也称为第II型细胞程序性死亡,是指细胞将自身胞质内物质运送到溶酶体降解、再利用的生物过程。研究表明TMZ能促进GBM细胞自噬,自噬在化疗中起到细胞保护的作用,导致细胞耐药;也有研究表明自噬作为一种细胞程序性死亡方式,其能增加GBM的化疗敏感性。因此目前自噬在GBM的化疗中所起的作用存在争议。本课题组在前期的研究中发现C19MC(The chr19q13.41 microRNA cluster)当中的miR-517c能够通过KPNA2干扰p53核质转运进而抑制GBM自噬及EMT,同样作为C19MC一员的miR-519a在GBM中的生物学作用如何?是否同miR-517c的功能一样也参与自噬的调节?是否也参与了 GBM对TMZ的化疗耐药?这些问题值得深入研究。本研究将探讨miR-519a在GBM中发挥的生物学作用及其分子机制;miR-519a对替莫唑胺化疗敏感性的影响以及与自噬的关系。第一章miR-519a靶向STAT3抑制GBM的恶性生物学行为目的:探讨miR-519a对GBM的恶性生物学行为的影响及其机制。方法:qRT-PCR检测GBM细胞株及肿瘤组织中miR-519a的表达水平,进一步对本单位和TCGA数据库中的GBM临床资料进行miR-519a与预后关系的生存分析;采用miR-519a mimics上调GBM细胞系和原代细胞的miR-519a,检测其对细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的变化;生物信息学预测靶基因,双荧光素酶报告基因系统验证预测的靶序列;qRT-PCR、Western-blot和免疫组化在细胞水平和肿瘤组织水平验证STAT3为miR-519a作用的靶基因;在GBM细胞系中共同转染pCDNA3.1-STAT3质粒和miR-519a mimics,验证STAT3的过表达能否逆转miR-519a对细胞生物学行为的影响。结果:在GBM中miR-519a的表达下调且与患者的预后呈正相关;miR-519a表达高,则GBM患者的生存时间长。过表达miR-519a能抑制GBM细胞增殖、侵袭和迁移能力。生物信息学分析提示STAT3 mRNA的3’UTR含有miR-519a直接作用的靶序列,双荧光素酶报告基因系统进一步验证该靶序列能与miR-519a结合,组织及细胞水平进一步验证miR-519a对Stat3蛋白表达的调控发生在转录后水平;过表达STAT3能逆转miR-519a对GBM细胞恶性生物学行为的抑制。结论:miR-519a在GBM细胞株中的表达降低;在GBM患者中,高表达miR-519a患者的预后好;STAT3介导了 miR-519a对GBM恶性生物学行为的抑制。第二章miR-519a介导自噬调控GBM细胞对替莫唑胺的敏感性目的:研究在GBM中miR-519a与替莫唑胺化疗敏感性之间的关系及其作用机制。方法:构建TMZ耐药细胞株U87-MG/TMZ,qRT-PCR检测并比较U87-MG与U87-MG/TMZ的miR-519a、STAT3的表达水平;在U87-MG和U87-MG/TMZ细胞中改变miR-519a的表达后,通过MTT、凋亡实验来检测细胞对TMZ敏感性变化;采用免疫荧光以及Western blot来检测并比较U87-MG及U87-MG/TMZ细胞的自噬水平;U87-MG和U87-MG/TMZ细胞中改变miR-519a的表达后,经特定浓度的TMZ作用,检测细胞的自噬水平以及凋亡蛋白的变化;通过自噬抑制剂或自噬诱导剂研究在miR-519a干扰下TMZ对GBM细胞的杀伤作用,同时Western blot检测并比较U87-MG及U87-MG/TMZ的STAT3/Bcl-2/Beclin 1通路的改变;分别将miR-519a inhibitor、Si-STAT3 和miR-519a mimics、pCDNA3.1-STAT3共转染至U87-MG和U87-MG/TMZ细胞中,TMZ刺激下检测细胞自噬水平、STAT3/Bcl-2/Beclin 1通路以及凋亡蛋白的变化。建立裸鼠皮下移植瘤模型检测miR-519a对GBM的化疗增敏作用,透射电镜检测各组肿瘤中自噬水平,wester-blot和免疫组化法检测LC3、p-Stat3(Y705)、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表达。结果:与亲本细胞U87-MG相比,U87-MG/TMZ细胞中miR-519a的表达水平下降;miR-519a增加了 GBM细胞对替莫唑胺的敏感性;miR-519a在TMZ的基础上诱导细胞发生了更强的自噬,自噬也介导了 miR-519a对GBM的化疗增敏作用;miR-519a诱导细胞发生自噬的机制是通过抑制Stat3蛋白的表达来激活自噬关键蛋白Beclin 1的表达;在动物体内进一步验证了 miR-519a对GBM的化疗增敏作用。结论:miR-519a增加GBM细胞对TMZ的敏感性;自噬介导了 miR-519a对GBM细胞化疗增敏的作用;miR-519a通过抑制STAT3/Bcl-2/Beclin 1通路诱导细胞发生自噬。