一、研究背景与目的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一种重要的医院院内感染病原菌,是引起医院获得性肺炎,尤其是呼吸机相关性肺炎的重要病原菌,也经常引起尿路感染、创伤感染、脑膜炎、腹膜炎、心内膜炎、关节炎症等感染类型,鲍曼不动杆菌可以进入血流,引起菌血症,并有可能进一步发展为败血症[1]。鲍曼不动杆菌耐药问题日趋严重,临床分离株中发现其耐药往往是多种耐药机制的共同作用的结果。药物外排泵机制是鲍曼不动杆菌重要的耐药机制,迄今为止已发现20余种外排泵,可以大致分为5大外排泵家族,其中最重要的为RND外排泵家族。鲍曼不动杆菌临床分离株具有能够从环境中获取耐药基因的能力,对碳青霉烯类抗生素的耐药机制往往多种耐药机制共同起作用,多种机制混杂在一起,从而造成药物泵出外排机制对细菌耐药的独立贡献难以评估,而且由单独由外排泵机制所产生的耐药限度的研究也比较少。我们希望通过体外诱导选择的方式获得外排泵机制的诱导耐药菌株,从转录水平和蛋白质水平两种维度去研究包含鲍曼不动杆菌多种外排泵与外膜蛋白基因的系统影响碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制。二、研究方法和结果研究方法:首先,我们选择了一株亚胺培南敏感的多重耐药鲍曼不动杆菌(SZE株),通过添加亚胺培南的选择压力下,连续58代次传代诱导选择的方法,获得了 SZE株的亚胺培南诱导株,监测诱导的过程中菌株在去除和添加外排泵抑制剂CCCP的药敏变化;其次,通过反转录定量PCR的方法,比较了 SZE株(G1)和其诱导株(G45)药物外排泵以及外膜蛋白在转录水平表达量变化情况,初步研究了造成诱导过程中亚胺培南耐药的外排泵和外膜蛋白的耐药机制;最后,通过iTRAQ同位素标记结合LC/MS技术,将鲍曼不动杆菌SZE株(G1)和其诱导株(G45)的蛋白质进行分别标记,利用蛋白质组学技术进行各种外排泵和外膜蛋白在蛋白质水平上的鉴定和定量比较,分析了 SZE株在持续的亚胺培南诱导下,多种外排泵和外膜蛋白在亚胺培南耐药机制中的作用。研究结果:1.近年来鲍曼不动杆菌临床分离株对妥布霉素、亚胺培南、头孢曲松抗菌药物的耐药性上升超过10%。在深圳市某三甲医院所分离的1167株临床株中,与2012-2013年度相比,2014-2015年度鲍曼不动杆菌的临床分离株对妥布霉素、亚胺培南、头孢曲松、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等种类抗菌药物耐药性均升高10%以上。2.鲍曼不动杆菌临床株中不同亚胺培南耐药水平的鲍曼不动杆菌外排泵基因adeB、adeJ的检出率的差异有统计学意义(P<0.01)。根据CLSI药敏标准判断,临床分离株中不同亚胺培南耐药水平的鲍曼不动杆菌外排泵基因adeB、adeJ的检出率的差异有统计学意义(P<0.01),临床株中携带外排泵adeB、adeJ基因与亚胺培南耐药正相关。3.鲍曼不动杆菌SZE株在亚胺培南(IPM)58代次的选择诱导下,最小抑菌浓度(MIC)从开始的0.125μg/ml上升到8μg/ml。通过筛选鲍曼不动杆菌菌株库,选定一株泌尿道感染来源的菌株并命名为SZE株;对其进行亚胺培南耐药的58代次的体外诱导选择中,SZE株对亚胺培南的药物敏感性逐渐下降,对IPM药敏平板上IPM抑菌圈直径从开始的24.5mm逐渐减小到13.8mm,最小抑菌浓度(MIC)从开始的0.125μg/ml上升到8μg/ml,根据CLSI对K-B法和肉汤稀释法亚胺培南药敏的解读,该菌株药敏判读从“敏感”变为“中介”。4.亚胺培南诱导过程中,鲍曼不动杆菌SZE株通过外排泵RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表达水平分别上调了 6.9、4.0和2.1倍,获得亚胺培南的适应性耐药性。经外排泵抑制试验,在亚胺培南诱导过程中SZE株所产生的亚胺培南药物敏感性下降基本上可以被外排泵抑制剂CCCP中和,我们推测该菌株诱导耐药的机制跟耐药泵机制相关。鲍曼不动杆菌SZE株经过多代的亚胺培南诱导选择,转录水平的多种外排泵基因表达量显著上调,RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表达上调超过2倍以上;外膜蛋白的carO,omp33,ompA,ompW和oprD表达量变化不显著。其中RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ分别上调了 6.9、4.0和2.1倍,MATE家族的abeM上调1.8倍,MFS家族tetB上调1.7倍,MATE家族的abeM上调1.8倍,SMR家族的abeS上调1.4倍。而MFS家族的craA,amvA变化不显著。而鲍曼不动杆菌亚胺培南诱导株(G45)外膜蛋白基因carO,omp33,ompA,ompW和oprD表达量变化不显著。诱导过程中,所携带的内源性blaOXA-51表达量变化不显著。5.鲍曼不动杆菌RND外排泵家族AdeABC的转录调节基因adeRS系统中,adeR基因序列的第58位易突变位点,该位点由G变为A是造成adeB相对表达量上调6.9的原因。adeRS系统中adeR基因序列的第58位发生了鸟嘌呤突变为腺嘌呤(G变为A),这个突变造成AdeR蛋白质序列中第20位的天冬氨酸突变为天冬酰胺,而这个突变或许是造成adeB相对表达量上调6.9的原因。6.通过比较蛋白质组学研究,筛选了 AdeB等5个外排泵相关蛋白和OmpA等7个膜相关蛋白是潜在的开发新型抗鲍曼不动杆菌的药物的靶标蛋白。SZE株经过多代的亚胺培南诱导选择,蛋白质水平上外排泵相关蛋白表达量上升 1.5 倍的有 5 个:分别为 AdeAmembranefusionprotein、AdeB、pH adaptation potassium efflux system transmembrane protein、pH adaptation potassium efflux system D transmembrane protein、Putative RND family drug transporter。而RND家族外排泵AdeABC组成蛋白AdeA和AdeB蛋白质水平的表达量上升分别为2.45和2.47。亚胺培南诱导株(G45)膜相关蛋白在蛋白质水平表达量表达量下降超过2倍的有7个,分别为Putative membrane protein、Putative membrane protein、MFS permease、Outer membrane protein assembly factor BamE、Putative membrane protein、OmpA/MotB、Outer-membrane lipoprotein carrier protein、Outer-membrane lipoprotein LolB。外膜蛋白表达量的下降可能与亚胺培南诱导株(G45)获得的耐药机制相关。这些所筛选的蛋白质水平上表达量发生变化的外排泵和外膜蛋白,或许可以作为开发新型抗菌药物的潜在的靶标蛋白。通过以上研究,分别在转录水平和蛋白质水平分析了 SZE株在持续的亚胺培南诱导下,多种外排泵和外膜蛋白在亚胺培南耐药中的作用机制。三、结论首先,我们研究发现近年来鲍曼不动杆菌临床分离株对多种抗菌药物的耐药性上升明显,携带外排泵adeB、adeJ基因与亚胺培南耐药正相关。2012-2015年来鲍曼不动杆菌临床分离株对多种抗菌药物的耐药性上升明显,特别是妥布霉素、亚胺培南、头孢曲松、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等种类抗菌药物耐药性均升高10%以上。临床分离株中不同亚胺培南耐药水平的鲍曼不动杆菌外排泵基因adeB、adeJ的检出率的差异有统计学意义(P<0.01),临床株中携带外排泵adeB、adeJ基因与亚胺培南耐药正相关。其二,临床常用的抗菌药物亚胺培南(商品名泰能)是一种潜在的鲍曼不动杆菌耐药诱导剂。鲍曼不动杆菌SZE株经亚胺培南(IPM)58代次的选择诱导下,对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性逐渐下降,最小抑菌浓度(MIC)从开始的0.125μg/ml上升到8μg/ml。再三,外排泵RND家族AdeABC、AdeFGH和AdeIJK的表达上调是鲍曼不动杆菌SZE株耐药性增强的重要原因,而外排泵调节系统-adeRS系统中重要位点发生的单核苷酸突变造成AdeABC外排泵的表达水平上升。鲍曼不动杆菌可以通过上调外排泵的表达水平,特别是RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表达水平获得亚胺培南的耐药性;鲍曼不动杆菌RND外排泵家族AdeABC的转录调节基因adeRS系统中,adeR基因序列的第58位易突变位点,该位点由G变为A可能是造成adeB相对表达量上调6.9的原因;其四,在缺少碳青霉烯酶耐药机制协同作用情况下,外排泵机制对鲍曼不动杆菌适应性耐药的独立贡献有限。亚胺培南敏感的多重耐药鲍曼不动杆菌(SZE株),通过在亚胺培南作用下,连续58代次传代诱导选择的方法,获得了 SZE株的亚胺培南诱导株最小抑菌浓度(MIC)从开始的0.125μg/ml上升到8μg/ml,但是该菌株在缺少碳青霉烯酶耐药机制协同作用情况下,通过上调外排泵表达水平作用机制,药敏结果根据CLSI标准判读:经过58代诱导,药敏趋于稳定,诱导作用的最大效果是由“敏感”变为“中介”,一直都无法进一步变成“耐药”。最后,通过比较蛋白质组学研究,筛选了 AdeB等5个外排泵相关蛋白和OmpA等7个膜相关蛋白可能成为潜在的开发新型抗鲍曼不动杆菌的药物的靶标蛋白。综上所述,本研究中我们从转录水平和蛋白质水平两种维度去研究包含鲍曼不动杆菌多种外排泵与外膜蛋白基因的系统影响碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制,外排泵耐药机制,特别是RND外排泵家族家族在鲍曼不动杆菌耐药中发挥重要作用,为多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)的临床治疗和新型抗菌药物的研制提供理论基础。