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研究背景:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是一种高死亡率、高致残率的出血性脑卒中,颅内动脉瘤破裂是SAH最主要的原因,约占全部病例的85%左右。动脉瘤破裂后动脉出血引起急性机械性脑组织损伤和颅内压升高,然后继发出现全脑缺血。蛛网膜下腔出血后缺血、组织损伤以及渗出的血液成分和降解产物可激活小胶质细胞和星形胶质细胞并破坏血脑屏障,引发炎症和其他级联反应。一旦血脑屏障被破坏,脑组织直接暴露在有害的血液成分和免疫细胞中,进一步加重了脑损伤。蛛网膜下腔出血后血脑屏障的破坏可能由多种机制引起,包括内皮细胞凋亡和紧密连接蛋白的破坏,其中可能涉及多个独立或相互关联的分子和信号通路,但目前确切的机制仍不清楚。载脂蛋白2(Lipocalin-2,LCN2)由活化的中性粒细胞分泌,是一种具有多种功能的急性期蛋白。目前已有众多研究表明LCN2在脑出血后急性期即可升高,在中性粒细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞均可表达,诱导这些细胞释放各种炎性因子,破坏血脑屏障并加重脑损伤。然而,这其中涉及的具体机制仍有待进一步深入研究。因此,本文将分两部分研究载脂蛋白2在蛛网膜下腔出血后血脑屏障破坏中的作用及机制。第一部分研究蛛网膜下腔出血后血脑屏障破坏的变化趋势,LCN2蛋白表达与血脑屏障破坏的关系和可能机制。第二部分研究LCN2在蛛网膜下腔出血后血脑屏障破坏的作用机制,涉及血管内皮细胞的损伤及其与1-磷酸鞘氨醇受体2的关系。实验方法:第一部分1.采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血(SAH)模型,健康野生型(wildtype)雄性C57BL/6小鼠,随机分为以下几组:假手术组(sham组),蛛网膜下腔出血后6小时组(SAH 6h组),蛛网膜下腔出血后12小时组(SAH 12h组),蛛网膜下腔出血后24小时组(SAH 24h组),蛛网膜下腔出血后48小时组(SAH 48h组),蛛网膜下腔出血后72小时组(SAH 72h组)。Sham组除线栓不刺破血管壁外,其余操作与SAH建模组相同。每组6只小鼠用于Western Blot检测蛋白表达情况。通过蛋白质免疫印迹检测各组小鼠在不同时间点同侧大脑皮质内血清白蛋白含量和中性粒细胞标记物MPO表达情况,依次推断SAH后血脑屏障破坏的变化趋势。2.使用健康雄性LCN2基因敲除(LCN2-/-)和野生型C57BL/6小鼠,野生型C57BL/6小鼠被随机分为假手术组(sham group)和野生型蛛网膜下腔出血组(SAH WT group),LCN2基因敲除C57BL/6小鼠被分为LCN2-/-蛛网膜下腔出血组(SAH LCN2-/-group)。SAH WT group和SAH LCN2-/-group小鼠被用做制作蛛网膜下腔出血模型,假手术组仅进行类似的手术操作但不刺破血管。通过免疫组织化学染色、TUNEL染色、FJC染色和蛋白质免疫印迹等方法检测各组小鼠大脑皮质内白蛋白含量,中性粒细胞浸润情况,小胶质细胞活化情况,氧化应激反应和继发性脑损伤程度以及神经元死亡情况。第二部分采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血(SAH)模型。使用健康雄性LCN2基因敲除(LCN2-/-)和野生型C57BL/6小鼠,野生型C57BL/6小鼠被随机分为假手术组(sham group)和野生型蛛网膜下腔出血组(SAH WT group),LCN2基因敲除C57BL/6小鼠被分为LCN2-/-蛛网膜下腔出血组(SAH LCN2-/-group)。SAH WT group和SAH LCN2-/-group小鼠被用做制造血管穿刺蛛网膜下腔出血模型,假手术组仅进行类似的手术操作但不刺破血管。通过免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹,观察SAH后大脑血管内皮细胞的损伤情况,1-磷酸鞘氨醇受体2的变化情况。结果:第一部分1.小鼠发生SAH后6小时,脑组织内白蛋白含量即有升高,在24小时至72小时之间持续处于一个较高的水平。2.小鼠发生SAH后12小时脑实质内的中性粒细胞标志物-髓过氧化物酶(MPO)升高,在24小时时达到峰值,后逐渐降低。3.野生小鼠SAH后24小时脑皮层组织内的LCN2含量显著增高而LCN2基因敲除(LCN2-/-)小鼠SAH后24小时皮层内未见LCN2蛋白表达。4.LCN2-/-小鼠SAH后脑皮层组织内白蛋白含量,MPO蛋白表达,小胶质细胞活化,热休克蛋白表达和神经元细胞死亡情况均较野生小鼠组显著减轻。第二部分1.SAH后LCN2-/-小鼠与野生小鼠相比,血管内皮细胞丢失相对减轻。2.SAH后内皮细胞上表达1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)蛋白,且SIPR2蛋白表达量与内皮细胞丢失相关。野生小鼠中S1PR2的蛋白表达水平在SAH后显著升高,而LCN2基因敲除可减轻S1PR2蛋白的升高。结论:1.SAH后24小时,脑皮层LCN2水平显著升高,同时脑组织内白蛋白和MPO也达到高峰,说明LCN2升高和血脑屏障破坏的时间趋势相仿,LCN2基因敲除小鼠中,SAH后血脑屏障破坏较少,从而介导LCN2敲除小鼠在SAH后的氧化应激和神经元细胞死亡也减少;2.LCN2敲除小鼠SAH后血管内皮细胞丢失减少,同时LCN2的缺失降低了SlPR2在内皮细胞上的表达量,从而减少了内皮细胞的丢失和血脑屏障的破坏。