视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一组遗传性、致盲性眼病，属于光感受器细胞及色素上皮(RPE)营养不良性退行性病变。病变部位首先发生在视网膜色素上皮层(RPE)，由于RPE失去吞噬视细胞外节脱落盘膜和代谢产物的能力，引起视网膜感光细胞进行性损伤，最终导致患者失明。其发病机制目前尚未完全明了。然而,在视网膜变性晚期视力丢失的患者，若其眼球保留则仍可感知昼夜节律的变化，经研究发现视网膜存在第三类感光细胞，即表达视黑素的视网膜神经节细胞(Melanopsin-expressing retinal ganglion cells， mRGCs)或称自主感光神经节细胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCs)。150年来传统上认为哺乳动物视网膜光感受器仅仅为视锥视杆细胞，mRGCs和它所表达的光敏感色素视黑素(Melanopsin)的发现，开辟了视觉领域里一种崭新的、令人兴奋的研究方向。Melanopsin属于G蛋白藕联受体超家族，由氨基酸组成的单肽链均有七螺旋跨膜结构，在第七螺旋处第336位点有一赖氨酸分子与视黄醛分子连接。光刺激使Melanopsin的视黄醛分子构象变化，启动光信号传递。在不感光的HEK-293细胞中表达Melanopsin发现其光敏感峰值在480nm左右，即对蓝光较敏感。虽然Melanopsin不具有较高的光敏感性和空间分辨率，但mRGCs不仅可以接受视锥视杆的输入信息，还可以接受内部视网膜的信息输入，重要的是mRGCs可以接受来自多巴能无长突细胞(DA ACs)的信息传递，具有通过视网膜下丘脑束(RHT)传导通路直接与大脑视交叉上核(SCN)等沟通的独特能力。因此,在视网膜变性晚期感光细胞功能丧失之后如何维持或提高mRGCs的功能变得尤为重要。据报道Melanopsin在急性和慢性视网膜变性过程中表达降低，但导致其表达降低的相关分子机制并不清楚。微小RNA在发育过程中具有重要作用，研究显示：microRNA参与一系列重要的细胞过程，从细胞增殖、细胞凋亡、恶性转化、到神经元发育。因此，本研究假设：RCS大鼠视网膜变性早期，DA ACs中miR-133b过表达并下调重要转录因子pitx3的表达，降低TH和D2受体的表达，抑制DAACs的发育、成熟和功能，致使DAACs受损。受损的DAACs合成与释放DA的能力明显降低，且与mRGCs间无法形成正常、有效的突触联系，最终导致Melanopsin的表达降低。本研究采用经典的视网膜色素变性动物模型RCS大鼠(皇家外科学院大鼠Royalcollege of surgeon rat)为动物模型，从microRNA水平探讨调节Melanopsin表达的分子机制。主要研究内容包括采用Western blot及qRT-PCR检测Melanopsin在视网膜变性过程中的表达变化；采用免疫组织化学染色、qRT-PCR、玻璃体腔注射D2受体激动剂研究多巴能无长突细胞DAACs及mRGCs的形态学特点和功能；采用microRNAqRT-PCR、原位杂交及免疫组织化学染色检测miR-133b在视网膜变性过程中的表达情况、定位及检测siRNA干扰miR-133b后Melanopsin变化情况。本课题在以下方面得到如下结果和结论：第一部分Melanopsin的表达水平在RCS大鼠视网膜变性过程中进行性降低研究发现与对照鼠相比视网膜变性过程中RGCs数目显著降低，而mRGCs的分布及数目在生后发育的整个过程中，甚至在视网膜变性晚期mRGCs数量没有显著改变。那么在视网膜变性过程中Melanopsin的表达分子水平如何？结果发现：1.Melanopsin表达无论是蛋白水平还是mRNA水平均降低。在变性早期p15时Melanopsin蛋白表达无明显变化，而Melanopsin mRNA表达水平高于对照鼠，考虑可能是由于RCS大鼠出生2周后睁眼接受光刺激而发生的生理性Melanopsin mRNA表达升高。P30时Melanopsin蛋白及mRNA表达与对照鼠相比均下降，变性中晚期p60、p90显著下降，甚至不易检测。2. Melanopsin与含有垂体腺苷酸环化酶(PACAP)的视网膜神经节细胞分布一致，表明Melanopsin存在于视网膜-下丘脑束含有PACAP的视网膜神经节细胞内，PACAP的mRNA表达水平可间接反映mRGCs的数量。研究发现PACAP mRNA表达水平在变性早期p15、p30略高于对照组，在中晚期p60、p90时无明显变化；而RGCs标志物Thy1.1的mRNA表达水平在RCS大鼠视网膜中随着病变的进展降低，即在p15Thy1.1表达升高，p30、p60、p90均表达降低。此结果与本实验室前期mRGCs及RGCs计数研究结果一致。以上结果提示在视网膜变性过程中Melanopsin的表达减少并不是由于mRGCs数目的降低，或许是由于调节Melanopsin表达的信号传导通路障碍所致。第二部分多巴能无长突细胞(DA ACs)分泌的多巴胺(DA)是调控Melanopsin表达的重要因素其它学者研究发现，DA是视网膜中主要神经活性物质之一，具有调节MelanopsinmRNA表达的能力，DA可能是通过mRGCs上的多巴胺受体Ⅱ(D2受体)发挥作用。DA主要由无长突细胞分泌，在视网膜信息处理过程中起重要的神经递质和调质作用，而酪氨酸在胞质内被酪氨酸羟化酶(TH)催化形成DA，TH是DA合成的限速酶，即TH是DA合成的重要调节因素。TH主要分布在视网膜多巴能无长突神经元，即DAACs或A18中，因此，TH是DAACs的可靠标志物。DA受体主要分为D1、D2两大类受体，D1受体激活腺苷酸环化酶、D2抑制腺苷酸环化酶。D2受体又分为轴突后受体和自身受体。视网膜光感受器和色素上皮的D2突触后受体和D2自身受体均可以反馈性调节多巴能神经元的多巴胺合成与释放。研究证明DA ACs和mRGCs树突共定位在视网膜IPL的S1亚层，DA ACs可指导RGCs树突分层，并为mRGCs选择性突触联系提供特异性指令。那么视网膜变性中Melanopsin的表达减少是否是由于TH、D2受体的表达降低或DA的合成、释放减少所致？视网膜变性过程中DA能神经元与mRGCs发生怎样的变化？结果发现：1.利用无长突细胞标记物calretinin行免疫荧光染色后，发现RCS大鼠视网膜内网状层(IPL)分层紊乱，特别是S1亚层结构模糊不清。而DA ACs位于INL的最内层，它的树突主要定位于IPL的S1亚层，表明DAACs的轴突样结构在视网膜变性过程中受到损害。另一方面，利用mRGCs的标记物Melanopsin行免疫荧光染色，结果显示mRGCs的树突在IPL的结构紊乱、阳性信号明显减弱，甚至在IPL和INL无法追踪，表明视网膜变性过程中mRGCs也受到损伤，导致mRGCs与DAACs无法形成正常、有效的突触联系。2. TH及D2受体的mRNA表达水平在视网膜变性过程中显著下降，D2的免疫荧光染色结果提示D2受体主要表达在INL最内层的DA ACs膜上和神经节细胞层(GCL)的神经节细胞同时也表达在外网层(OPL)和IPL网间细胞的轴突上。但是D2受体的表达在上述各部位的表达均有减少。3.在玻璃体腔给予D2受体激动剂R()-propylnorapomorphine hydrochloride(NPA)激活D2受体通路后发现Melanopsin表达水平得以恢复甚至提高。以上研究结果提示：视网膜变性过程中mRGCs表达Melanopsin的能力没有丧失，Melanopsin的表达降低可能与DA ACs功能损害有关。第三部分过表达的MicroRNA133b及下调的转录因子，pitx3，控制Melanopsin的表达微小RNA在发育过程中具有重要作用。它参与一系列重要的细胞过程，从细胞增殖、细胞凋亡、恶性转化、到神经元发育等。其它学者发现在中脑的多巴能神经元中，miR-133b与pitx3形成的负反馈调节多巴能神经元的发育、成熟与功能，那么是否视网膜中miR-133b与pitx3间也形成了同样的负反馈调节？是否miR-133b在视网膜变性过程中呈现过表达状态从而导致了DA ACs的功能衰竭？那么如何挽救DAACs功能，从而恢复Melanopsin的表达？结果发现：microRNA，miR-133b特异性地表达在视网膜DAACs中，并且在RCS大鼠视网膜变性早期阶段(p15)显著表达增高，同时，miR-133b与pitx3共定位于DAACs中。过度表达的miR-133b下调了重要转录因子pitx3的表达。表明：在视网膜中miR-133b与pitx3同样形成了负反馈调节。由于DA ACs中miR-133b过表达下调pitx3的表达水平，从而抑制了DA ACs的发育、成熟和功能。Pitx3低表达降低了TH和D2受体的表达以及多巴胺产生。一方面受损的DA ACs与mRGCs之间不能形成有效的突触联系；另一方面由于DA的减少最终导致Melanopsin的表达降低。应用siRNA干扰miR-133b后，DAACs中pitx3和TH表达上调，恢复了DA的合成与释放，从而使Melanopsin表达水平得以恢复。综上所述，本课题得出如下结论：1、在microRNA水平上阐明了Melanopsin表达的调控机制。Melanopsin表达减少原因并不是mRGCs数目减少所致，而是由于miR-133b过表达和pitx3的表达下降导致DA ACs在视网膜变性过程中功能受损，明显削弱了DA/D2的相互作用，引起Melanopsin表达减少。2、RCS大鼠视网膜中TH和D2mRNA及蛋白表达降低是mRGCs中Melanopsin表达减少的主要原因，表明DA是调控非视觉成像系统的重要因素。此外，由于视觉成像系统的光感受器表面也表达大量多巴胺受体家族分子，因此，DA是调控视觉成像与非成像系统的重要分子。间接地反映了非视觉成像系统与视觉成像系统之间存在直接的联系。3、siRNA/miR-133b上调TH、D2以及Melanopsin，证明视网膜变性过程中mRGCs表达Melanopsin功能并未受损，并且通过挽救DAACs功能可以恢复Melanopsin表达，这为晚期视网膜色素变性的临床治疗提供理论了依据。