背景：胰腺癌是目前已知恶性程度最高的肿瘤之一,它生长迅速,早期症状隐匿,发现时多已发生转移,且对化疗药物敏感性不好,目前唯一证实有效的治疗方法是手术切除。然而,由于发现多为晚期,只有少数病人有手术机会,且即使是术后5年生存率也在12%～20%之间。在西方国家,胰腺癌已列死亡率最高的恶性肿瘤第4位。胰腺癌的病因目前仍未研究清楚,多种环境因素和多个基因异常被认为在其发生过程中起作用。其中,癌基因的激活和抑癌基因的失活起到了重要作用。K-ras基因是胰腺癌发生发展中最为重要的原癌基因。K-ras蛋白是小分子G蛋白,当它与GTP结合时为活性状态,可进一步激活下游信号通路,调控细胞生长、增殖。正常情况下,Ras蛋白是一类在组织中广泛存在的信号通路中心分子,具有重要生理功能。当Ras蛋白突变时,构型改变,始终处于被激活的“锁定”状态,不需外界生长信号就可以持续激活下游信号分子,导致细胞无节制地异常增殖,最终发生肿瘤。本实验室多年来研究一个与K-ras基因具有同源性,而功能相反的抑癌基因ARHI,研究表明其作用可能通过抑制Ras经典信号通路实现,甚至可以抑制Ras基因的表达。其与Ras相互作用的机制有待进一步研究。K-ras基因的突变类型多为点突变,尤以第一外显子的第12位密码子点突变最为多见。由于其为胰腺癌发生中的早期事件,又有突变频率高,突变类型固定的特点,临床上已将该位点作为胰腺癌早期诊断的新的分子标志物之一。此外,人们也希望将该位点作为胰腺癌早期治疗的新的靶点。RNA干扰技术的出现,给这种希望赋予了更大的可能。其高度特异性降解目标mRNA的特性,可特异性针对突变型的K-ras基因产生效应,而保留正常K-ras基因的功能。目前已有许多体外实验和动物体内实验进行这方面的尝试。目的：对K-ras突变型胰腺癌细胞系,特异性敲除K-ras基因,观察对胰腺癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响,初步探讨K-ras下游信号通路的改变情况,同时观察ARHI表达的情况。方法：应用RNA干扰技术,采用脂质体介导的转染小干扰RNA (siRNA)的方法,瞬时转染PANC-1、MiaPaCa-2两株细胞系,通过荧光显微镜和流式细胞仪测定转染率。优化条件后从RNA和蛋白水平验证K-ras基因的转录和表达水平。继而观察K-ras干扰前后胰腺癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,以及K-ras相关的下游经典信号通路Ras-Raf-ERK和Ras-PI-3K/AKT中的核心蛋白ERK和AKT的表达情况。以CCK-8细胞活力检测试剂检测细胞增殖；以流式细胞仪PI染色法测定细胞凋亡和细胞周期；以凋亡小体染色和吖啶橙染色观察干扰后细胞凋亡增多的形态学表现；以荧光实时定量PCR验证K-ras表达下调情况下细胞周期相关因子Cyclin A和Cyclin E以及ARHI等的mRNA相对定量情况；以Western Blot检测功能性ERK、功能性AKT和总AKT,以及与AKT调控有关的抑癌基因p53的蛋白水平和ARHI蛋白水平变化。结果：脂质体介导的siRNA转染效率在两个细胞株均可达90%以上。针对K-ras突变类型设计的siRNA可特异性敲除相应的K-ras基因,而不干扰其他突变类型。24h和48h提取的RNA均随siRNA浓度升高产生明显K-ras mRNA下调,siRNA终浓度达100nM时干扰效果最明显。干扰K-ras之后,MiaPaCa-2细胞增殖受到明显抑制,重复测量方差分析p<0.05, PANC-1细胞差异未达显著。两株细胞系的凋亡率均增加,干扰组PANC-1、MiaPaCa-2凋亡细胞的百分率分别为22.6%和32.1%,相对于对照组的9.7%和17.3%有显著性差异(p<0.05)。凋亡形态学观察可以得出相同的结论。细胞周期发生停滞,G1期增加,S期和G2期减少,PANC-1和MiaPaCa-2的G1期比例分别由50.4%、58.7%上升到65.1%和67.4%；S期由32.4%、26.5%下降至21.8%、21.7%；两期的变化有明显差异,p<0.05,而G2期差异不显著；细胞周期相关因子Cyclin A和Cyclin E在mRNA水平有下降趋势,除MiaPaCa-2的cyclin A相对水平降至0.4以外,其余下降幅度均未达50%。p-ERK、p-AKT蛋白表达明显下调,而总AKT无明显变化；p53表达明显上调。蛋白水平变化于96h时更为明显。ARHI蛋白在干扰后仍无表达,荧光实时定量PCR有差异,但因表达量太低,差异不明确。结论：对胰腺癌细胞株瞬时转染特异性siRNA可特异性干扰K-ras突变序列,使MiaPaCa-2细胞增殖受到抑制,两株细胞凋亡增加,细胞周期停滞；可明显下调K-ras下游关键信号蛋白的表达,抑制相关信号转导通路。K-ras与ARHI基因之间的关系仍需进一步研究明确。