前言:口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是头颈部恶性肿瘤中最常见的病理类型。尽管在OSCC的诊断、手术和肿瘤治疗方面取得了进展,但过去30年中患者的5年生存率仍仅为50%左右。由于慢性炎症通常与较差的预后相关,因此了解肿瘤微环境在OSCC进展过程中的参与方式至关重要。肿瘤的内部结构比正常组织复杂得多,其特定的肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）由各种基质细胞和免疫细胞组成,并且贯穿从肿瘤早期发生到进展和转移的各个阶段。有研究报道,肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAMs）在与TME相关的免疫细胞中占恶性实体瘤体积的5-50%,参与调节癌症相关的炎症、免疫逃逸、基质重塑和癌症转移。来自TAMs的细胞因子和促炎因子在恶性转化的不同阶段发挥着关键作用。TAMs可分为两类,一类是经典激活的M1巨噬细胞,抑制肿瘤的发展;另一类是选择性激活的M2巨噬细胞,能够促进肿瘤发展,但是具体机制尚不清楚。双特异性磷酸酶-1（dual-specificity phosphatase-1,Dusp1）,又称丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase,Mkp-1）,是最早发现的Mkps成员,其编码基因位于5q35.1,在人类细胞对环境应激反应以及细胞增殖的负调控中发挥重要作用。Dusp1通过去磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPKs）上的苏氨酸-谷氨酸-酪氨酸基序,可以抑制p38、Erk和Jnk的表达。Dusp1已被证明参与不同的生物学过程,如代谢信号、骨骼肌功能、炎症反应和癌症发展。DUSP1基因在膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等多种癌症的原发灶中表达降低,同时在近80%的转移组织中也出现低表达。另有关于卵巢癌的研究表明,DUSP1可能在抑制丝足形成从而在细胞运动中起关键作用。虽然有研究报道在乳腺癌中,激活p38和Erk信号通路可诱导M2型巨噬细胞产生IL-8,促进肿瘤的迁移和侵袭。然而,目前对DUSP1在肿瘤组织中的研究大多局限于应用原位杂交和免疫组化检测其mRNA水平和蛋白表达水平,尚不清楚DUSP1在TME中是否直接作用于炎症免疫细胞发挥作用。前期我们课题组通过免疫组化、Western Blot和Realtime PCR检测了DUSP1在人OSCC组织中的表达情况,结果发现DUSP1在OSCC组织中呈低表达,且与肿瘤进展密切相关。结合前期研究结果及文献,本研究拟利用Dusp1全身敲除和骨髓条件性敲除小鼠模型研究肿瘤微环境中Dusp1缺失在口腔鳞状细胞癌的发生发展中的作用,并初步揭示DUSP1引导TAMs募集、极性和影响OSCC转移的机制,为OSCC靶向药物的研发奠定理论基础。材料与方法:1、实验材料:Dusp1基因全身敲除型小鼠（C57BL/6）,Dusp1基因骨髓条件性敲除型小鼠（C57BL/6）,小鼠同源口腔癌细胞系MOC2。2、实验方法:肿瘤细胞培养、TCGA数据库分析、小鼠背部皮下成瘤、小鼠口腔原位成瘤、4NQO药物诱导小鼠成瘤、免疫细胞分选、巨噬细胞培养、划痕实验、流式细胞仪技术、H&E染色、免疫组织化学染色、mRNA提取和Nanostring等。结果:1 DUSP1在TCGA数据库OSCC组织中表达水平分析结果在TCGA数据库中,比较DUSP1基因在口腔鳞癌和正常口腔黏膜组织中的表达情况。结果显示:与正常口腔黏膜组织相比,DUSP1在OSCC组织中表达呈显著性降低（P<0.05）;同时,我们将正常黏膜组织分别同颈部淋巴结转移不同分期（N0、N1、N2、N3）的患者癌组织中DUSP1表达情况进行比较,结果显示:颈部淋巴结转移N0、N1、N2期的患者口腔癌组织中DUSP1表达与正常组织中相比,同样呈显著性降低（P<0.05）。2 Dusp1全身敲除小鼠背部皮下成瘤检测结果应用C57/BL6小鼠同源细胞系MOC2进行Dusp1全身敲除小鼠的皮下成瘤实验,结果发现:Dusp1敲除小鼠相对于野生型小鼠具有更快的皮下成瘤,结果具有显著性差异（P<0.05）。3.Dusp1全身敲除小鼠口腔原位成瘤的淋巴结转移情况的检测结果由于背部成瘤在动物伦理限定条件下,无法得到转移淋巴结,所以我们设计了小鼠口腔原位成瘤实验。应用C57/BL6同源小鼠细胞系MOC2进行Dusp1全身敲除小鼠口底原位成瘤实验,应用H&E染色检测小鼠淋巴结转移比率,结果发现:Dusp1全身敲除小鼠颏下淋巴结转移比率62.5%（10/16）高于野生型31.25%（5/16）。4.Dusp1骨髓条件性敲除小鼠4NQO诱导肿瘤成瘤、进展和病理分型检测结果在以上实验结果基础上,为进一步探索Dusp1是否通过骨髓来源免疫炎性细胞对OSCC的发生发展产生影响,设计了4-硝基喹啉1-氧化物（4-nitroquinoline oxide,4NQO）诱导Dusp1骨髓条件性敲除小鼠成瘤实验。结果显示:Dusp1骨髓条件性敲除小鼠产生OSCC,相对于对照组具有更大的成瘤面积、更快的肿瘤进展和更低分化的病理分型（P<0.05）。5.Dusp1全身敲除小鼠肿瘤中CD45+炎性细胞检测结果。应用组织化学染色方法检测Dusp1全身敲除小鼠肿瘤中CD45+炎性细胞,结果发现:在Dusp1敲除小鼠的肿瘤组织中,肿瘤中心处CD45阳性细胞较野生型多,结果具有显著差异（P<0.05）;而在肿瘤的边缘,二者无差异（P>0.05）。接下来,我们设计实验制备Dusp1敲除小鼠和野生型小鼠肿瘤细胞单细胞悬液,使用CD45+显微磁珠标记后进行分选,发现在Dusp1敲除小鼠的肿瘤组织中,分选得到的CD45+炎性细胞较野生型显著增多（P<0.05）。6.Dusp1全身敲除小鼠的TME中炎性细胞成分检测结果使用流式细胞仪对制备的CD45+细胞悬液进行检测,比较Dusp1全身敲除小鼠与野生型小鼠TME中各种炎性细胞成分的差异。结果发现:Dusp1敲除小鼠TAMs中的M2型巨噬细胞相较于野生型小鼠显著增多（P<0.05）,B细胞则显著减少（P<0.05）。Dusp1敲除小鼠与野生型小鼠的CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg、Gr-1+细胞、M-MDSC、PMN-MDSC、M1巨噬细胞、NK细胞或树突状细胞的数目无显著差异（P>0.05）。7.Dusp1通过TAMs对MOC2细胞迁移影响的检测结果通过对分选出的Dusp1敲除和野生型TAMs分别进行培养,而后提取无血清培养液离心后的上清液,使用该上清液进行MOC2细胞划痕实验。结果显示:与野生型小鼠TAMs上清液相比,Dusp1全身敲除小鼠TAMs上清液培养的MOC2细胞其划痕愈合速度显著加快（P<0.05）。8.Dusp1敲除小鼠TAMs差异表达基因的筛选与功能分析结果通过磁珠标记分选出TAMs进行mRNA提取和Nanostring实验,获得Dusp1敲除小鼠和野生型小鼠TAMs间显著差异的基因63个,其中高表达30个、低表达33个;根据GO分析等结果,选择若干差异显著的调控基因簇亚群进行再分析,发现这些基因在MAPK信号、Notch信号、骨髓来源相关基因和细胞因子/趋化因子信号、血管生成、代谢应急等相关信号通路中发挥重要作用。结论:1、Dusp1敲除促进口腔鳞状细胞癌的发生发展;2、Dusp1敲除促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型转化,可能是OSCC转移的原因之一;3、Dusp1敲除可能通过影响多种骨髓来源基因、细胞因子、趋化因子等信号通路参与OSCC发生发展。