LKB1,同时也被称为SKT11,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。目前很多肿瘤中均发现了LKB1基因突变,如肝癌、肺癌、宫颈癌等,因此将其定义为肿瘤抑制基因。人类的LKB1肿瘤抑制基因被认为是许多细胞进程和信号通路的重要调控子,包括细胞周期阻滞,细胞凋亡,Wnt信号通路,Ras诱导的细胞转化,AMPK信号通路,以及能量代谢和细胞极性的调控。T336位点是LKB1上的一个主要的自磷酸化位点,早期研究发现T336位点突变为Glu会阻止LKB1抑制G361细胞生长的活性。这也就暗示我们可能会有一些蛋白能够通过T336的磷酸化水平来负调控LKB1。研究结果显示LKB1在胚胎和成人组织中都有不同水平的广泛表达。在小鼠胚胎中LKB1基因高表达,之后LKB1主要在心,肾,肺等部位表达。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是LKB1的一种最重要的底物,它是真核细胞在ATP水平较低的情况下存在的一种主要的细胞应激因子。AMPK可以通过病理性刺激被激活,如氧化性损伤、渗透压改变和糖剥夺。LKB1可以在体外直接磷酸化AMPK的Thr-172并活化AMPK。在LKB1缺乏的小鼠胚胎中几乎没有检测到AMPK的Thr-172位点的磷酸化。LKB1-AMPK信号通路在调控细胞生存和死亡,包括凋亡和自噬过程中扮演着重要的7角色。14-3-3蛋白是一个高度保守的蛋白家族,在广泛的细胞进程中具有重要的作用。其中包括信号转导,细胞周期调控,凋亡,细胞代谢,细胞骨架结构以及恶性转变等。14-3-3在哺乳动物中有七种不同基因编码的亚型,分别为β,ε,ζ,η,θ,y and σ,在体内约有200多种蛋白与14-3-3具有相互作用。14-3-3的不同亚型具有各自的结合蛋白。14-3-3γ过表达会促进细胞增殖以及诱导肿瘤细胞多倍体的产生。研究发现,14-3-3γ在肝癌组织中的表达高于肝正常组织。本课题组的前期工作发现LKB1能够与14-3-3相互作用,并只能与14-3-3γ、(?)和ζ三种结合较紧密,并揭示了LKB1与14-3-3蛋白相互作用的一个结合位点为LKB1上的T336磷酸化位点,同时还发现LKB1的下游底物AMPK可以与14-3-3竞争性结合LKB1。本研究希望能在原发性肝癌发生发展过程中以及在不同细胞(HL7702,HepG2,Hela,A549)中检测LKB1、14-3-3丫与p-AMPK(Thr172)蛋白的表达规律,同时寻找能调控LKB1-T336位点磷酸化的条件,进一步探讨14-3-3与LKB1相互作用的生理意义。结果显示14-3-3γ在正常肝细胞HL7702中的表达水平低于肿瘤细胞,在HepG2,A549和Hela这几种细胞中,HepG2中的表达水平最高；LKB1位点的磷酸化水平在正常肝细胞HL7702中的表达水平高于HepG2和A549细胞；而LKB1T336在肿瘤细胞HepG2和A549的磷酸化水平比正常肝细胞高。Hela为LKB1缺失型细胞株,因此检测不到LKB1的表达。在原发性肝癌模型中,我们的研究结果显示,14-3-3γ的肝肿瘤发生过程中的表达水平呈递增趋势,而LKB1和p-AMPK呈递减趋势,其中p-AMPK在肿瘤形成时完全不表达,这说明三种蛋白之间的表达存在一定的相关性。在寻找LKB1-T336位点磷酸化条件的实验中,我们用胰岛素、过氧化氢和血清缺乏条件刺激正常细胞HEK293细胞,结果发现血清缺乏6小时后可以检测到LKB1-T336位点的磷酸化,而且磷酸化的水平会随着时间明显增强。此外,在研究14-3-3对LKB1和AMPK在生理学上的作用的实验中,细胞在转入LKB1野生型质粒和14-3-3后,14-3-3明显具有减弱LKB1介导的细胞周期G1阻滞的作用,但转入LKB1T336A突变型质粒的和14-3-3后,细胞周期阻滞没有变化。结论：细胞内源性蛋白检测结果说明在LKB1,14-3-3γ和AMPK的表达具有相关性,并且LKB1和14-3-3γ的相互作用可能会影响LKB1、AMPK和14-3-3γ在细胞中的表达水平。在大鼠肝癌模型中,14-3-3γ和p-LKB1T336在肝癌发生过程中的表达具有明显的时间依赖性和相关性,可以作为一种新型的肿瘤检测指标。在探讨LKB1T336位点磷酸化的试验中,血清缺乏6小时可以提高LKB1T336和AMPKT172的磷酸化水平,而14-3-3的表达水平却降低。过表达14-3-3揭示了高浓度的14-3-3会与AMPK竞争性结合LKB1,因此LKB1与AMPK的结合能力下降,使AMPK上的T172的磷酸化水平降低。在细胞中共转LKB1和14-3-3后,14-3-3可以减弱LKB1对细胞周期G1期的阻抑,说明14-3-3与LKB1相互作用后可以调节LKB1对细胞周期的作用。