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胃癌是癌症死亡的第三大主因,其因缺乏特异的生物性标志所以早期检出率较低,且预后较差,丞待发现新的化疗药物。Jaspine B是从海洋海绵Jaspis和Pachastrissa sp中发现的一种天然鞘脂类分子,具有显著的生物学活性,因此Jaspine B及其衍生物的研究成为热门靶点。本课题中,我们探讨了 Jaspine B衍生物M-2对胃癌细胞的抗肿瘤作用及其分子机制,主要结论如下:(1)用 MTT 法检测了 M-2 对胃癌细胞(MGC803、HGC27、SGC7901)和胃上皮正常细胞(GES1)的抗增殖作用。结果表明,M-2抑制胃癌细胞(MGC803、HGC27、SGC7901)的增殖且对胃上皮正常细胞(GES1)基本无毒性。(2)为了确定M-2诱导胃癌细胞死亡的机制,我们采用了流式细胞仪通过Annexin V-FITC/PI双染法收集细胞,发现死亡细胞主要集中在区域Annexin V-FITC+/PI+内。然后用MTT法检测Caspases抑制剂Z-VAD-fmk与M-2联用的结果,发现与凋亡阳性对照shikonin相比,Z-VAD-fmk未能逆转M-2引起的死亡率。最后用Hoechst染色检测M-2处理后细胞核形态的变化,发现与凋亡阳性对照shikonin相比,M-2未引起细胞核出现凋亡特征变化。以上结果说明,M-2引起胃癌细胞非凋亡性死亡。(3)根据上一步结论推测M-2可能引起胃癌细胞发生程序性坏死,所以通过免疫印迹法检测M-2处理胃癌细胞后坏死蛋白表达量的变化,结果表明坏死蛋白表达量明显增加。且MTT法检测表明RIP3-/-MGC细胞对M-2不敏感,免疫印迹法检测M-2处理RIP3-/-MGC细胞后RIP3、p-MLKL表达量未增加。以上结果表明M-2引起胃癌细胞发生程序性坏死。(4)因为在显微镜下观察到胃癌细胞在处理M-2后出现空泡,所以推测M-2可能诱导自噬的发生。为了检测自噬是否发生,采用了免疫共沉淀检测发现M-2处理胃癌细胞后Beclin1与Bcl-xl发生解离,且免疫印迹法检测发现LC3Ⅱ、ATG家族蛋白表达量增多。以上结果表明M-2诱导胃癌细胞发生自噬。(5)MTT法检测发现ML385增加了 M-2对胃癌细胞的抑制作用,这说明M-2可能激活了 Nrf2途径。免疫印迹检测发现p-Nrf2和HO1表达量增多,且免疫荧光和核质分离试验发现Nrf2发生从细胞质到细胞核定位的转移,这表明Nrf2途径被激活。而免疫印迹检测发现ML385进一步增加了 M-2引起的坏死蛋白RIP3、p-MLKL的增多,表明Nrf2途径抑制程序性坏死。以上结果表明,M-2在胃癌细胞中激活Nrf2途径。(6)已有文献表明,自噬可以通过P62竞争性结合KEAP1从而激活Nrf2。所以推测M-2诱导的自噬通过激活Nrf2途径来抑制程序性坏死。为了自噬与Nrf2途径和程序性坏死的联系,采用了自噬抑制剂3-MA和BafA1分别与M-2联用。MTT检测发现3-MA促进了 M-2对胃癌细胞的抑制作用,而BafA1作用相反。免疫印迹法检测发现3-MA抑制了 M-2引起的p-Nrf2的增多但同时促进了 M-2诱导的坏死蛋白RIP3、p-MLKL的增多,而BafA1表现出与3-MA相反的结果。此外,免疫共沉淀检测发现3-MA抑制了 M-2诱导的P62与KEAP1结合量的增多,而BafA1促进了 M-2诱导的P62与KEAP1结合量的增多。最后,siP62转染MGC803后,进一步增加了 M-2诱导的胃癌细胞的死亡。以上结果表明,自噬通过P62激活Nrf2途径从而抑制程序性坏死。(7)为了检测M-2对肿瘤细胞体外侵袭迁移的影响,我们采用了 Transwell实验和划痕实验。Transwell实验表明M-2处理组细胞侵袭数明显低于对照组,划痕实验表明M-2处理组划痕愈合面积明显低于对照组。且免疫印迹实验表明M-2降低了Vimentin的表达量,增加了 E-Cadherin的表达量。以上结果说明,M-2在体外显著抑制了胃癌细胞的侵袭迁移。(8)结合以上所有结果可以推导得出结论:M-2在胃癌中诱导自噬和程序性坏死的发生,同时自噬可以通过P62激活Nrf2途径并抑制程序性坏死。