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目的：
肺纤维化是许多不同病因肺间质性疾病的常见结局，其典型特征是细胞外基质蛋白过度沉积、血管生成和重构、肺实质不可逆瘢痕形成，导致气体交换减少和肺功能受损。本研究旨在观察博来霉素诱导的大鼠肺纤维化病程中血管新生情况，探讨加味补阳还五汤通过miR-126和VEGF在体内和体外对肺纤维化大鼠的保护作用及其机制，拟为肺纤维化的治疗提供新思路新方法。
方法：
1.体内实验：健康雄性清洁级SD大鼠，年龄7周，体重180±20g。随机分为对照组，模型组，强的松组，补阳还五汤组和加味补阳还五汤组。利用博来霉素气管滴入法建立肺纤维化模型。造模后24小时，对照组给予生理盐水灌胃，强的松组给予强的松混悬液(4.2mg/kg·d)灌胃，补阳还五汤组给予补阳还五汤液(4.9g/kg·d)灌胃，加味补阳还五汤组予加味补阳还五汤液(7.3g/kg·d)灌胃。各组动物均在14天、28天随机分批处死，取大鼠肺组织，HE染色观察肺组织病理变化，Masson染色观察肺组织中胶原含量、分布和形态学变化，免疫组化Ⅷ因子染色标记肺血管，显微镜下计算微血管数目，测定微血管密度(MVD)，RT-PCR法检测肺组织中miR-126及VEGFmRNA的水平，Westernblot法及免疫组化法检测肺组织VEGF蛋白表达，免疫组化法比较各组肺组织中HIF-1α蛋白表达情况。
2.体外实验一：在TGF-β1刺激的MRC-5中转染miR-126模拟物或抑制剂及其阴性对照物，探究miR-126与VEGF的关系。MRC-5随机分为6组：对照组，模型组，miR-126mimics组，miR-126mimicsNC组，miR-126inhibitor组，miR-126inhibitorNC组。48h后收集细胞，采用MTT法检测细胞增殖。对照组、模型组应用RT-PCR法检测α-SMA和fibronectin基因表达，验证造模效果。6组均用RT-PCR法检测miR-126、VEGFmRNA水平，Westernblot法比较各组VEGF、collagenⅠ、collagenⅢ蛋白水平，免疫荧光法观察collagenⅠ、collagenⅢ表达。二：探究加味补阳还五汤含药血清对TGF-β1诱导的MRC-5miR-126、HIF-1αmRNA及VEGF的影响。MRC-5随机分为4组：对照组，模型组，正常血清组，加味补阳还五汤含药血清组。RT-PCR法检测MRC-5中miR-126、HIF-1αmRNA及VEGFmRNA的水平，Westernblot法比较各组中VEGF和collagenⅠ表达情况。
结果：
1.体内实验：(1)HE及Masson染色结果显示，加味补阳还五汤可以显著减轻纤维化大鼠肺组织炎症及纤维化改变，且疗效优于补阳还五汤；(2)Ⅷ因子染色结果显示，博来霉素诱导大鼠肺纤维化病程中存在病理性血管新生亢进，微血管密度增加；加味补阳还五汤可以显著抑制纤维化大鼠肺组织病理性血管新生；(3)加味补阳还五汤可以降低纤维化大鼠肺组织中miR-126、VEGF及HIF-1α蛋白的表达。
2.体外实验：(1)纤维化细胞模型中，miR-126、VEGFmRNA及蛋白表达显著增加；(2)miR-126mimics可升高miR-126、VEGFmRNA及蛋白表达水平，并促进胶原蛋白合成；miR-126inhibitor可抑制miR-126、VEGFmRNA及蛋白表达，并降低胶原蛋白合成；(3)加味补阳还五汤含药血清可降低TGF-β1所致MRC-5胶原蛋白Ⅰ合成；(4)加味补阳还五汤含药血清可降低TGF-β1所致MRC-5中miR-126、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA及蛋白表达。
结论：
加味补阳还五汤对博来霉素所致肺纤维化大鼠具有明显的保护作用，且疗效优于补阳还五汤，其作用机制可能与抑制miR-126/VEGF表达从而抑制肺组织中病理性血管新生相关。
肺纤维化是许多不同病因肺间质性疾病的常见结局，其典型特征是细胞外基质蛋白过度沉积、血管生成和重构、肺实质不可逆瘢痕形成，导致气体交换减少和肺功能受损。本研究旨在观察博来霉素诱导的大鼠肺纤维化病程中血管新生情况，探讨加味补阳还五汤通过miR-126和VEGF在体内和体外对肺纤维化大鼠的保护作用及其机制，拟为肺纤维化的治疗提供新思路新方法。
方法：
1.体内实验：健康雄性清洁级SD大鼠，年龄7周，体重180±20g。随机分为对照组，模型组，强的松组，补阳还五汤组和加味补阳还五汤组。利用博来霉素气管滴入法建立肺纤维化模型。造模后24小时，对照组给予生理盐水灌胃，强的松组给予强的松混悬液(4.2mg/kg·d)灌胃，补阳还五汤组给予补阳还五汤液(4.9g/kg·d)灌胃，加味补阳还五汤组予加味补阳还五汤液(7.3g/kg·d)灌胃。各组动物均在14天、28天随机分批处死，取大鼠肺组织，HE染色观察肺组织病理变化，Masson染色观察肺组织中胶原含量、分布和形态学变化，免疫组化Ⅷ因子染色标记肺血管，显微镜下计算微血管数目，测定微血管密度(MVD)，RT-PCR法检测肺组织中miR-126及VEGFmRNA的水平，Westernblot法及免疫组化法检测肺组织VEGF蛋白表达，免疫组化法比较各组肺组织中HIF-1α蛋白表达情况。
2.体外实验一：在TGF-β1刺激的MRC-5中转染miR-126模拟物或抑制剂及其阴性对照物，探究miR-126与VEGF的关系。MRC-5随机分为6组：对照组，模型组，miR-126mimics组，miR-126mimicsNC组，miR-126inhibitor组，miR-126inhibitorNC组。48h后收集细胞，采用MTT法检测细胞增殖。对照组、模型组应用RT-PCR法检测α-SMA和fibronectin基因表达，验证造模效果。6组均用RT-PCR法检测miR-126、VEGFmRNA水平，Westernblot法比较各组VEGF、collagenⅠ、collagenⅢ蛋白水平，免疫荧光法观察collagenⅠ、collagenⅢ表达。二：探究加味补阳还五汤含药血清对TGF-β1诱导的MRC-5miR-126、HIF-1αmRNA及VEGF的影响。MRC-5随机分为4组：对照组，模型组，正常血清组，加味补阳还五汤含药血清组。RT-PCR法检测MRC-5中miR-126、HIF-1αmRNA及VEGFmRNA的水平，Westernblot法比较各组中VEGF和collagenⅠ表达情况。
结果：
1.体内实验：(1)HE及Masson染色结果显示，加味补阳还五汤可以显著减轻纤维化大鼠肺组织炎症及纤维化改变，且疗效优于补阳还五汤；(2)Ⅷ因子染色结果显示，博来霉素诱导大鼠肺纤维化病程中存在病理性血管新生亢进，微血管密度增加；加味补阳还五汤可以显著抑制纤维化大鼠肺组织病理性血管新生；(3)加味补阳还五汤可以降低纤维化大鼠肺组织中miR-126、VEGF及HIF-1α蛋白的表达。
2.体外实验：(1)纤维化细胞模型中，miR-126、VEGFmRNA及蛋白表达显著增加；(2)miR-126mimics可升高miR-126、VEGFmRNA及蛋白表达水平，并促进胶原蛋白合成；miR-126inhibitor可抑制miR-126、VEGFmRNA及蛋白表达，并降低胶原蛋白合成；(3)加味补阳还五汤含药血清可降低TGF-β1所致MRC-5胶原蛋白Ⅰ合成；(4)加味补阳还五汤含药血清可降低TGF-β1所致MRC-5中miR-126、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA及蛋白表达。
结论：
加味补阳还五汤对博来霉素所致肺纤维化大鼠具有明显的保护作用，且疗效优于补阳还五汤，其作用机制可能与抑制miR-126/VEGF表达从而抑制肺组织中病理性血管新生相关。