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棕榈油酸(16：1A9)是一种由16个碳原子组成、含有一个双键的ω-7脂肪酸。棕榈油酸具有重要的营养、医药和工业用价值。例如,棕榈油酸可增加细胞膜的流动性,减少血液中胆固醇含量,防止心律失常,抑制肿瘤发生等功能。相反,它的前体物质棕榈酸(16：0)则被证实可引起血液中胆固醇含量升高,增加心脏性疾病和结肠癌等肿瘤疾病发生率。在工业上,新近发现棕榈油酸及顺式-11-十八碳烯酸(18：1△11)等co-7脂肪酸可直接用于高效生产工业需求量较大的1-辛烯。而且棕榈油酸还具有较好的抗低温和抗氧化特性,非常适于制取优质的生物柴油。自然界仅有一些野生植物种子能高水平积累棕榈油酸,由于其种子小、产量低等不良性状限制,不能商业化生产,因此难以满足急剧增长的市场需求。大豆(Glycine max)和油菜(Brassica napus)等普通油料作物种子仅合成微量或不含棕榈油酸。然而普通油料作物种子和多数植物组织均能合成积累大量棕榈油酸的前体分子棕榈酸,预示着通过基因修饰在普通油料作物种子和其他组织中组装棕榈油酸合成途径的可能性。为此本研究综合应用基因组学、分子生物学和基因工程等技术,解析棕榈油酸生物合成调控机制,在普通油料作物大豆种子和模式植物烟草(N. tabacum L.)营养组织中组装棕榈油酸合成途径,以期培育富含棕榈油酸的大豆和烟草新种质。这种新型大豆油不仅营养价值优异,更益于食用和制作具有特殊功效的保健食品,也可以用于生产优质生物柴油。组装棕桐油酸合成途径于生物量大的烟草叶片等营养器官中培育出新型烟草种质,不仅可以用于培育优质燃油型烟叶,而且还可以在不与人类竞争粮食的前提下专用于生产生物柴油,从而实现这种可再生“绿色能源”的商业化生产,增加烟草种植的经济效益。本研究获得一系列新发现,主要包括：1.酰基-△9脱氢酶催化棕榈酸(16：0)生成棕榈油酸(16：1△9),是在大豆和烟草中代谢组装棕桐油酸(16：1△9)生物合成途径所需的关键酶之一。本文分别从酿酒酵母(Saccharomyees cerevisiae)和平菇(Pleurotus ostreatus)分离到编码细胞型CoA-A9脱氢酶的cDNA克隆,即ScCoA-A9D (1533 bp)和PoCoA-A9D (1272 bp)。应用营养缺陷型酵母表达体系,首次获得ScCoA-A9D和PoCoA-A9D对棕榈酸(16：0)有较高底物特异性的实验证据,并证明ScCoA-A9D蛋白第309处的甘氨酸(G309)和PoCoA-A9D蛋白第237处的甘氨酸(G237)是酶活性关键位点之一。采用农杆菌浸润矮牵牛叶片瞬间表达方法对PoΔ9D和ScA9D实验证明,这两个来自真菌的细胞型CoA-A9脱氢酶能在高等植物细胞组织中正常行使功能,催化CoA-16：0形成CoA-16：1。这为在高等植物细胞质内质网上组装棕榈油酸合成途径提供了必备靶基因。2.ACP-Δ9脱氢酶是另一类酰基-△9脱氢酶,它在质体内催化ACP-16：0生成ACP-16:1Δ9。以高含棕榈油酸的猫爪草(Cat’s Claw) (Macfadyena unguis-cati L.)发育种子为材料,分离到编码质体型ACP-△9脱氢酶的cDNA克隆,即MucACP-Δ9D(1188 bp)。应用E.Coli表达MucACP-Δ9D和纯化酶蛋白、底物同位素标记和体外生化反应等实验鉴定了MucACP-Δ9D酶活性和底物特异性,首次实验证明MucACP-Δ9D对底物ACP-16:0有较高选择性。该cDNA克隆可用于在植物细胞叶绿体中组装棕榈油酸合成途径。3.以大豆为宿主植物,通过亚细胞定位表达酵母酰基-△9脱氢酶(ScA9D),以达到提高大豆种子中棕榈油酸的含量,同时降低饱和脂肪酸的含量。构建种子特异表达载体,利用基于体细胞胚的基因枪轰击法,转化大豆宿主细胞,并获得转基因植株和成熟种子。基因表达和蛋白质检测,以及成熟种子脂肪酸成分分析证明,ScA9D分别在细胞内质网和质体中正确表达和行使功能。与野生型和空载体转化植株不同,大豆种子特异表达ScA9D导致细胞中棕榈酸(16：0)转化成棕榈油酸(16：1△9)。与细胞质内质网定位表达相比,质体定位表达ScA9D产生更多的棕榈油酸和棕榈油酸的碳链延长产物顺式-十八碳烯酸(18：1A11)。这表明酵母酰基-A9脱氢酶在质体内功能比在内质网上更强。此外,种子特异表达ScA9D还引起大豆种子中多不饱和脂肪酸(18：2和18：3)以及饱和脂肪酸(16：0和18：0)含量相应减少。显然,在该基因修饰步骤的下游,油脂合成途径存在某种机制以回补脂肪酸成分的改变。首次实验证实细胞型酰基-A9脱氢酶能在质体内更有效行使功能,这为应用细胞型酰基-A9脱氢酶蛋白工程提高普通油料作物种子油中棕榈油酸含量开辟了新路径。4.以烟草为宿主植物,构建组成型表达载体,采用农杆菌介导法遗传转化烟草,分别在细胞质内质网和质体内定位表达酵母酰基-A9脱氢酶(ScA9D),以期提高营养组织中棕榈油酸(16：1△9)的积累量和分析该酶不同亚细胞定位表达对油脂代谢的影响。与野生型和空载体(对照)植物相比,转基因烟草植株叶片中单不饱和的棕榈油酸及顺式十八碳烯酸(18：1△11)含量明显提高,而饱和的棕榈酸(16：0)含量相应减少,多不饱和的亚油酸(18：2△9,12)和亚麻酸(18：3△9,12,15)含量亦降低。ScA9D质体定位表达烟叶中棕榈油酸及顺式十八碳烯酸含量分别是ScA9D细胞质内质网定位表达烟叶的2.7和1.9倍。这表明酵母酰基-△9脱氢酶能在高等植物细胞中正确催化棕榈酸(16：0)转化为棕榈油酸(16：1△9),而且在质体内表达的效应显著高于在细胞质内质网上的效应。新建立了一种应用酰基-CoA-△9脱氢酶代谢工程培育植物绿色组织高水平合成积累棕榈油酸等ω-7脂肪酸的策略,有助于在生物量大的烟叶等营养器官中组装ω-7脂肪酸合成途径以生产优质生物燃油。本研究所获得新发现有促于全面解析植物油脂合成,特别是稀有脂肪酸合成调控机制,为大豆等油料作物以及烟草等种子和营养器官油脂代谢途径的有效组装和遗传改良提供新的基因元件和技术,进一步拓展植物油脂可再生资源的工业应用。