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果实酸度是决定果实品质的重要指标之一,柑橘果实中的有机酸以柠檬酸为主,柠檬酸的积累受其合成、降解和转运三方面因素的影响。本实验室前期通过花后45和142天四个不同酸度的甜橙品种（正常酸度的纽荷尔脐橙、新会橙,低酸的冰糖橙及无酸的埃及糖橙）果实的转录组进行整合系统生物学的研究,揭示了甜橙果实酸度相关基因调控网络中有15个枢纽基因,本研究对其中的2个关键基因CsAPL2/Cs6g08410和CsAVP1/Cs3g15070进行了进一步分析。CsAPL2（APD2-LIKE2）是拟南芥APD2（ABERRANT POLLEN DEVELOPMENT 2）在甜橙中的直系同源基因,APD2基因编码一种RING finger家族泛素化蛋白,该基因突变导致花粉的异常发育,研究报道APD家族蛋白与细胞内膜相关,可能参与了细胞内分子的跨膜运输,AtAPD2在体外具有E3连接酶的活性。AVP1（ARABIDOPSIS THALIANA V-PPASE 1）是编码拟南芥液泡膜上Ⅰ型H+-PPase的基因,有关报道认为V-PPase对有机酸转运至液泡积累的过程起重要作用,成熟期果实酸度的下降主要是液泡膜渗漏增加所致,然而质子泵是如何对果实有机酸含量产生影响的至今还不清楚。尽管我们实验室已经鉴定出这两个基因与酸度相关,但是这些基因的表达特征还未有研究报道,本研究的主要目的是分析它们的转录调节模式及其与整个果实发育期间果实酸度的相关性。在本研究中,除了前期研究所用的四个甜橙品种,对高酸的夏橙和锦橙也一并进行比较研究,以期提供更多与果实相关的信息。首先,我们分析CsAPL2和CsAVP1基因在这六个不同酸度品种中是否存在编码区的序列差异,并且比较了苹果、草莓等不同类型果实的直系同源基因的蛋白质序列和特性。其次,分析这两个基因在根、茎、叶片、雄蕊、花和成熟果实中的转录表达特征。然后,我们测定6个甜橙品种不同发育时期果实（即开花后70、100、130、160、190、220和250天）的酸度,并分析CsAPL2和CsAVP1在果实发育期间的转录水平,以鉴定基因表达是否与果实发育和酸度变化相关。此外,我们测定了这两个基因在锦橙实生幼苗受到盐和渗透压胁迫及脱落酸、生长素和赤霉素等激素处理后的转录水平。最后,我们分析这两个基因在二倍体草莓中的基因表达特征,研究这些草莓直系同源基因（FvAPL2/gene18873与FvAVP1/gene31580）在不同果实结构但同为非呼吸跃变型的果实中是否有相同的基因表达特征。主要研究结果如下:1.CsAPL2基因的克隆与表达分析以6个甜橙品种的果实为材料克隆了CsAPL2的CDS序列,通过蛋白序列预测、保守结构域和系统进化树分析,确定CsAPL2为C3HC4型RING finger家族的一员。尽管我们没有发现CsAPL2的CDS序列在这6个不同品种有差异,测序结果表明CsAPL2比已发表的甜橙基因组序列中的Cs6g08410基因序列多出两个小片段,但不造成移码。对CsAPL2基因在纽荷尔脐橙的不同器官中的表达分析,发现该基因的表达具有果实偏向性。而且对6个甜橙品种不同发育时期的果实中的表达分析结果表明,该基因在高酸和正常酸品种中的表达水平明显高于低酸品种,通过对CsAPL2基因表达水平与果实的有机酸含量变化进行皮尔森相关性分析,我们发现在果实发育早、中期CsAPL2基因的转录表达水平与夏橙、新会橙和锦橙的有机酸含量变化呈显著正相关,推测CsAPL2基因可能参与了果实中有机酸的合成,但是在花后220到250天时,尽管果实酸度不再升高,CsAPL2的转录水平却继续升高,可能在果实最后成熟阶段该基因有不同的功能。此外,在胁迫条件下和激素处理后的实生苗的表达分析发现,CsAPL2表达受NaCl上调但是被PEG6000抑制,IAA、ABA与GA3对CsAPL2的表达仅有轻微影响。最后,我们发现二倍体草莓中的FvAPL2基因的表达特征与CsAPL2不尽相同,FvAPL2没有果实倾向性的特异,尽管不能排除其在某一特定发育阶段中果实酸度控制的作用,但是其表达与果实酸度相关性不强,不过与果实发育相关,随着果实成熟其表达水平升高,在果实成熟中很可能具有潜在的作用。2.CsAVP1基因的克隆与表达分析对6个甜橙品种的果实cDNA进行CsAVP1的CDS测序结果表明,该基因在6个品种中没有序列差异。蛋白序列预测、保守结构域和系统进化树分析表明,CsAVP1蛋白含有一个H+-PPase的保守结构域,可能具有V-PPase活性。对CsAVP1基因在纽荷尔脐橙的不同器官中的表达分析,发现该基因在所有器官中均有表达,但是在根中表达特别强。通过对CsAVP1基因在6个甜橙品种不同发育时期的果实表达分析发现,CsAVP1基因在果实发育初期表达水平较高,该基因在高酸和正常酸品种中的表达水平明显高于低酸品种,而且,CsAVP1基因转录水平与果实有机酸含量变化的相关性取决于果实发育阶段,在前期有机酸积累时（花后70-100天）没有显著相关性,但是在后期有机酸消减过程中（花后130-190天）,CsAVP1基因的表达水平与纽荷尔脐橙、夏橙和新会橙有机酸含量变化呈显著正相关,推测CsAVP1基因可能参与了液泡中有机酸的运输。此外,我们发现在锦橙实生苗中CsAVP1在转录水平的表达受NaCl的显著上调,但是PEG6000没有影响,而且受ABA与GA3的微弱诱导,IAA没有效果。和CsAVP1不同,FvAVP1在二倍体草莓的果实和雄蕊中表达较强,但是在果实发育过程中没有显著的表达差异。综合以上结果,我们发现CsAPL2和CsAVP1基因在转录水平上的调节模式既有相同点又有不同之处。CsAPL2具有果实倾向性的表达,而CsAVP1在果实中表达较弱,但是这两个基因在低酸品种中的转录水平均比正常酸和高酸品种中低,这与我们实验室前期仅用花后42和145天这两个发育阶段得出的结论一致。但是,通过整个果实发育阶段的表达变化比较,我们发现CsAPL2的表达在正常、高酸甜橙果实花后70-190天与酸度正相关,而CsAVP1只在后期有机酸消减过程中（花后130-190天）呈现正相关。不过,这两个基因的转录水平在正常、高酸甜橙品种果实成熟的最后发育阶段（花后220-250天）又重新上升,可能这两个基因在果实成熟过程有不同的功能。此外,这两个基因的转录水平都受NaCl和ABA调节,今后有必要在果实中分析它们是否受逆境影响,进而参与果实发育过程中的酸度调控。我们在草莓的初步研究发现,这两个基因在草莓果实中都表达,但是FvAVP1的转录水平与酸度变化无关,而FvAPL2只在果实发育前期与酸度正相关,也许表明甜橙和草莓这两类果实在酸度控制中具有一些相似又有较大差异的基因表达调控机制。总之,本研究的结果增强了我们对这两个基因和果实发育与酸度控制相关性的了解,为今后进行基因功能分析提供了重要依据。