论文部分内容阅读
在原核生物体内,二元调控系统是信号传导的最重要的方式。它通常含有一个作为感应分子的组氨酸激酶和一个下游的应激调节蛋白。感应蛋白特异地与调节蛋白发生磷酸转移,从而引起一系列的细胞的应激反应。一般来说,大部分感应分子都是膜定位的,二聚化是其必须的活性功能单位。目前有一千多个二元调控系统系统在不同物种中被发现,然而跨膜的感应分子如何接收膜外信号并将其传递到膜内一直没有明确的证据。
DctB-DctD二元调控系统是根瘤菌生物固氮所必须的,控制着细菌对碳源的摄取与代谢。DctB作为定位在膜上的感应蛋白,有两个穿膜区,分别位于N-末端和蛋白的中间序列。在两个穿膜区之间是伸在膜外用来接收信号的感应区。生理学研究表明,DctB可以感受不同的四碳二羧酸,如琥珀酸,马来酸等。在第二个穿膜区入膜以后,紧接着是膜内的一个coiled-coil铰链区(RAMPlinker)。然后在蛋白C-末端是含有组氨酸的磷酸转移结构域(HPt)及ATP结合与催化结构域。目前关于HPt结构域及催化结构域已经有较多的结构和突变体数据,而对于膜外感应区及膜内的HAMP铰链区的了解还很不充分。根据已有的几个受体的结构及膜内HAMP铰链区的结构,人们分别提出了信号接收与传递的模型。然而现有的模型都不够有说服力,均是建立在不同的假设之上。如LuxPQ模型认为在没有配体存在时,LuxPQ与LuxPQ’之间有一个2次对称轴,而HAMP模型则假设观察到的结构为构象变化后的coiled-coil结构,默认无信号时是标准的(canonical)coiled-coil构象。因此,获得DctB结合配体前后的结构对于原核生物信号传递研究有重要意义。
本论文选取中华苜蓿根瘤菌组氨酸激酶DctB作为研究对象,其膜外感应区、穿膜区及膜内部分结构域被克隆并在大肠杆菌中重组表达。本论文获得了DctB膜外区的不同构象,分别是DctB与四碳二羧酸琥珀酸的复合物结构、DctB与三碳二羧酸丙二酸的结构及没有任何配体时DctB的结构。这些结构表明,DctB膜外区由两个PAS结构域组成,二者之间由一个螺旋连接。DctBN-末端还有参与二聚化的三个螺旋。配体结合只在离膜较远的PAS结构域发生,另一个没有发现任何配体结合。配体结合前后结构的比较分析表明,DctB结合丙二酸并不会造成结合位点构象变化,而结合琥珀酸之后却会将整个结合位点拉紧。发表的生理数据表明DctB只能感应四碳二羧酸,配体结合前后构象变化与生理实验结论是一致的。随着配体结合后结合位点的构象变化,整个蛋白二聚体的二聚面也有很大变化,而这个变化足以引起跟随近膜PAS区的穿膜螺旋及膜内HAMP铰链区的构象变化。根据配体结合前后的不同构象的结构,本论文提出了一个膜外感应的组氨酸激酶功能模型。
论文第二部分结合结构生物学和生化手段研究了枯草芽孢杆菌中YvgN和YtbE两个醛酮还原酶。此两个蛋白序列相同性有75%,但是根据发表文献它们可能有不一样的细胞定位和生物学功能。通过X-射线晶体学,获得了apoYvgN和apoYtbE的结构,发现YvgN和YtbE结构有很高的相同性,每个单体之间的RMSD小于0.9A。同时该论文解析了YvgN和其辅基NADPH的复合物的结构,由此推断出辅基结合位点。在holoYvgN的结构中,还发现在辅基的尼克酰胺环的B面附近有三个稳定的水分子,由此推测出YvgN的底物结合方式。YvgN和YtbE在辅基和底物结合位点相同性更高,为了分析二者的差异,本论文选择了一系列醛酮还原酶的可能底物来测定二者的酶活性。结果显示,YvgN和YtbE具有相似的酶活性,都表现出对邻对位硝基或卤素取代后的芳香族醛类的特异性。醛酮还原酶在真核和原核中差异集中体现在辅基和底物结合位点,该研究结果对于设计特异性识别原核生物的抗生素类药物提供了依据。