一、研究背景耳聋是一种严重影响人类生活质量最常见的感觉障碍疾病之一。先天性内耳畸形(congenital inner ear malformation)是儿童感音神经性耳聋(sensorineural hearing loss,SNHL)的主要病因,其中遗传性耳聋是导致耳聋最常见的内耳畸形。Mondini型是内耳可能在胚胎期第7周发育异常形成的耳蜗不完全发育畸形。Mondini畸形在儿童的发病率可达1/1000至1/2000。本课题组发现的耳聋大家系是世界上首个由内耳畸形导致的大动物疾病模型,为人类Mondini畸形耳聋机理、治疗方法提供理论基础和实验动物,对于诊断和治疗耳聋具有重大意义。本课题组发现了遗传性内耳畸形耳聋猪,并建立遗传性耳聋家系。在构建出内耳畸形遗传猪家系基础上,本课题也进行了相关听功能研究、病理形态研究、转录组学研究。本课题组进行耳聋疾病的遗传规律验证,根据遗传连锁分析进行基因定位发现发现新致病基因为SOX10。本课题的内耳畸形遗传性大家系将在耳聋机理阐明、耳蜗移植、干细胞治疗和基因治疗等方面具有良好的应用前景。二、研究方法1.家系建立首先使用105mg/kg剂量的乙酰基亚硝基脲(ENU)耳静脉滴注巴马公猪ENU诱变后,带有突变基因的精子和野生型母猪交配,产生突变F1代。F1代突变个体与野生型交配出生F2代,扩繁F2代建立突变群体,F2母猪与F1公猪回交配种出生F3代。扩繁建立显性突变家系。2.模型特性研究2.1采用Smart EP诱发电位仪,分别对正常和和白化内耳畸形耳聋的巴马香猪进行听性脑干反应测试,测试3次取平均值。2.2采用石蜡切片、火棉胶切片对正常和白化内耳畸形耳聋巴马香猪的皮肤、眼睛和耳蜗进行检查。2.3使用扫描电镜对正常和白化内耳畸形耳聋巴马香猪进行检测。2.4采用高分辨率螺旋CT、MRI磁共振水成像影像学对正常和白化内耳畸形耳聋巴马香猪的耳蜗进行检查。3.基因定位使用gwas方法进行关联和连锁分析方法,对白化内耳畸形耳聋巴马香猪进行基因定位。三、研究结果1.耳聋家系建立使用enu诱变巴马香猪的方法能够产生带有突变基因的精子。我们发现带有此突变基因的精子能够产生具有耳聋突变的f1代。此耳聋突变能够显性遗传给后代。通过扩繁方法成功建立了耳聋显性突变家系。2.耳聋模型特性研究2.1脑干听觉诱发电位(abr)检测结果:听力检测发现白化内耳畸形巴马香猪为重度耳聋。将野生型巴马香猪和内耳畸形巴马香猪分别麻醉后采用smartep诱发电位仪进行脑干听觉诱发电位(abr)检测,结果表明所有参测的白化内耳畸形耳聋巴马香猪在各频率的仪器最大输出为110db,均不能引出abr峰,表现出重度耳聋。而野生型巴马香猪均能引出正常abr峰,听力阈值在40~60dbspl间。2.2耳蜗火棉胶切片结果:实验结果表明内耳畸形猪内耳基底圈正常,耳蜗发育不完全,骨迷路和膜迷路坍陷,耳蜗的中阶塌陷,耳蜗的血管纹萎缩、螺旋器上的毛细胞和螺旋器神经节细胞均退化,呈mondini畸形耳聋。皮肤和眼睛的石蜡切片检测实验显示:野生型巴马香猪的虹膜是棕色,白化内耳畸形耳聋巴马香猪表现出虹膜变浅的特征,颜色明显变淡,呈浅蓝色。使用石蜡切片进行组织学观察,表明突变个体的视网膜色素上皮细胞层rpe细胞的黑色素颗粒明显少于正常个体。选取野生型猪和白化内耳畸形耳聋猪的白皮肤做对照,发现:和野生型猪相比,白化猪的黑皮肤的色素明显变少。选取野生型猪和内耳畸形猪的黑皮肤做对照,发现:和野生型猪相比,白化内耳畸形巴马香猪的黑皮肤的色素明显变少。2.3使用扫描电镜对巴马香猪进行检测。发现猪的耳蜗结构和人的类似,包括前庭结构、3个半规管和毛细胞形态。只是巴马香猪的耳蜗旋转的圈数为3.5圈。发现一共有4排毛细胞,而内毛细胞只有1排。沿着耳蜗基底膜排列着,最里面是内毛细胞,外面是外毛细胞,形态比较规则。2.4高分辨率螺旋ct、mri磁共振水成像影像学结果:根据实验发现白化内耳畸形耳聋猪内耳为mondini畸形。对耳聋猪和野生型猪分别进行了高分辨率螺旋ct、mri磁共振水成像影像学诊断及耳蜗组织学、超微结构检测,实验结果表明野生型巴马香猪耳蜗为3周半,而突变猪耳蜗螺旋仅1周半,其耳蜗基底圈正常,耳蜗的顶圈和第二圈融合,且无前庭导水管扩大及其它病理变化。3.耳聋基因定位使用gwas关联和连锁分析法对白化内耳畸形耳聋巴马香猪家系进行基因定位。进行GWAS关联和连锁分析发现内耳畸形突变基因定位于5号染色体的约100余个基因区域,对该区域的候选基因SOX10基因进行了测序。对遗传性白化内耳畸形耳聋猪(TB007T095XXXX)基因定位结果为:导致内耳畸形的突变位于SOX10基因的第2外显子(c.325A>T,R109W)。突变位点位于109位氨基酸。突变位点和白化内耳畸形耳聋性状共分离,在患病猪中为杂合子AT,野生型猪中为纯合子AA。四、结论本课题使用乙酰基亚硝基脲(ENU)诱变巴马公猪后,带有突变基因的精子和野生型母猪交配的方法发现并建立了内耳畸形耳聋猪家系。使用GWAS方法成功对遗传性内耳畸形猪(TB007T095XXXX)进行基因定位(突变位点位于109位氨基酸,在内耳畸形猪中为杂合子AT)。使用ABR、MRI、CT、石蜡切片、火棉胶切片、转录组检查等发现了内耳畸形猪的病理、生理改变。本研究说明使用诱变的方法能够建立遗传性内耳畸形耳聋大型哺乳动物模型,GWAS方法能够对常染色体显性遗传内耳畸形突变猪进行基因定位。本研究通过遗传性内耳畸形猪家系的构建、基因定位、发病特性研究,为猪作为人类耳聋疾病动物模型打下坚实基础。此遗传性耳聋猪遗传家系将在耳聋发病机理阐明、耳蜗移植等研究具有良好应用前景的大动物疾病模型。