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在重组毒构建过程中,为了便于筛选和纯化,常常需要绿色荧光蛋白、LacZ等筛选标记,构建好的重组病毒基因组中含有这些报告基因,不符合商业疫苗生物安全的要求和基因工程疫苗的种毒标准。因此,将重组体中的报告基因去除是非常重要的内容。本研究利用Cre-loxp系统去除了重组毒的报告基因,最终获得了只含表达禽流感病毒(AIV )H5亚型血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒,并对其进行了初步的免疫效力测定。主要研究内容如下:1.禽痘病毒通用转移载体的构建以禽痘病毒(FPV)282E4株基因组DNA为模板,PCR扩增了2.35kb大小的禽痘病毒F30序列作为同源重组臂。将含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白基因插入F30序列基因构建转移载体,通过首次转染、筛选,获得了表达GFP的重组禽痘病毒。二次转染过程中通过Cre重组酶,去除了重组病毒基因组的GFP基因,达到了去除报告基因的目的。实验结果表明,以GFP作为筛选标记使重组病毒的纯化更为简便,同时利用Cre-loxP系统可以轻松地去除报告基因,为目的基因重组禽痘病毒的构建创造条件。2.表达禽流感病毒H5血凝素重组禽痘病毒的构建以含HA基因pH308为模板,通过PCR扩增了H5亚型禽流感病毒HA基因,构建含禽痘病毒复合启动子、SV40 PolyA的H5 HA基因表达盒。将H5血凝素基因和GFP基因表达盒克隆入禽痘病毒F30基因构建了转移质粒载体pPH5,将转移质粒载体与脂质体混合转染已感染FPV 282E4株的CEF细胞,利用免疫荧光初次筛选了表达H5和GFP的禽痘病毒重组体。通过二次转染,利用Cre-Loxp系统自动敲除重组病毒中的GFP基因,最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组禽痘病毒。免疫荧光和病毒复制效率测定结果表明,经过6次传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5血凝素。3.表达H5亚型HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力测定