IHNV分离及感染的分子基础研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:chenjl12341234
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传染性造血组织坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus;IHNV)可造成大多数鲑科鱼类等冷水鱼的急性和高致死性疾病;发病鱼主要表现为燥乱狂游、肾脏及脾脏等造血器官出血坏死等症状。自二十世纪中期北美洲首次发现该病短短的几十年以广泛流行于世界各地。我国上世纪八十年代在东北地区冷水鱼体内也相继发现;该病对全世界鲑鳟鱼养殖造成了严重的经济损失;而目前并没有有效地防治疫苗及药物; MyD88/AP-1通路主要参与细胞增殖、炎症反应、胚胎着床及生理、病理妊娠过程。为此本实验通过对白山市半野生某冷水鱼疑似IHNV发病养殖场进行病料采集;通过电镜观察、鲑鱼性腺细胞感染、病毒基因提取克隆及测序等方法对病毒进行分离鉴定。同时以健康的花羔红点鲑鱼为实验动物;并运用流式细胞技术对健康花羔红点鲑进行倍性分析;选择同一倍性的花羔红点鲑对分离鉴定得到的病毒进行感染。分别在攻毒后24h、72h和240h对花羔红点鲑进行分子取样;收集肝脏进行转录组测序。分析测序结果并筛选寻找对MyD88/AP-1信号通路的相关基因抑制剂以探究该通路对IHNV的响应;为鲑鱼科类传染性造血组织坏死病毒的发病和病毒复制奠定了理论基础;对防治IHNV提供有效地支持。取得以下结果:  1.分离获得野生IHNV病毒鉴定方法及结果如下:镜下感染虹鳟鱼性腺细胞发现36h后细胞开始出现病变;同时当病毒滴度10-5.6时;孔内50%的细胞发生病变;对其基因序列分析建立进化树后发现分离株与HV7106株同源性最高;达97.01%;与美国的220-09株;HO-7株;WRAC株;SRCV株为不同的进化分支;对同一倍性花羔红点鲑感染后发病症状与自然条件下鱼体发病症状基本一致;感染7d后;死亡率达83%。  2.通过花羔红点鲑人工感染IHNV病毒转录组测序结果分析如下:转录组测序后经过测序质量控制;共得到94.05Gb Clean Data;各样品Q30碱基百分比均不小于 88.90%;表明测序结果良好;选择 BLAST 参数 E-value 不大于 10-5和HMMER参数不大于10-10;最终获得42315个有注释信息的Unigene。将IHNV攻毒240h的实验组;S10、S11、S12和空白对照组;即S1、S2、S3中的差异基因利用 COG 数据库对其基因产物进行直系同源分类。根据 SNP 位点的等位(Allele)数目;即测序Reads支持的不同碱基的数目;可以将SNP位点分为纯合型SNP位点(只有一个等位)和杂交型SNP位点(两个或多个等位)。不同物种杂合型SNP所占的比例存在差异;选择差异基因;并通过RT-PCR对选择的基因进行验证;与对照组相比;经IHNV感染后的花羔红点鲑肝脏中上述基因的表达水平结果与转录组分析结果基本一致。  3.MyD88/AP-1 通路对病毒的影响研究分析结果如下:选择 AP-1 抑制剂去甲二氢愈创木酸并作用于 Toll 样受体信号通路 AP-1 基因;采用实时荧光定量PCR;设计上下游引物;β-actin 为内参;AP-1 基因的表达水平明显下调;作用12h时达到最低值;下调1倍;24h时表达量有所回升;P38在3h时表达量已开始降低;12h时降低约4倍;24h时开始升高;6h和12h时与其他处理组有极显著差异(P<0.01)。IL-1β表达水平在NDGA处理后的第12h极显著降低;且12h内一直成降低趋势;各处理组与0h时相比有显著差异(P<0.05)。
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