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本文采用抗病基因同源序列法,进行云南悬钩子蔷薇抗病基因同源类似物(RGAs)的克隆与分析研究,同时从GenBank数据库下载蔷薇属植物的RGAs序列和不同物种的Mlo基因序列,将下载的这些序列进行生物信息学分析。主要研究结果如下:
1、根据抗病基因核苷酸结合位点(Nucleotide binding site,NBS)保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,通过RT-PCR扩增及克隆,从云南悬钩子蔷薇中共获得28个含有NBS-LRR完整结构域的抗病基因同源序列,且全部属于nonTIR-NBS-LRR类型。以R加上克隆号命名,28条RGAs核苷酸序列相似性在31.2%~96.6%间变化,氨基酸序列相似性在16.3%~99%之间变化。相似性搜索发现,无论核苷酸还是氨基酸序列,它们与蔷薇属上已克隆的NBS类RGAs相似性都很高,同时搜索到某些植物上已克隆的NBS类抗病基因。它们与已知的NBS类白粉病抗病基因在氨基酸水平上的相似性为10.8%~34.4%,进一步聚类发现,28条序列与拟南芥的ADR1基因和小麦W150、puc5a、Tp4b5a、Tp4b5b基因聚为一大类。综合分析得出结论,28序列都为潜在的白粉病抗病基因序列。
2、从GenBank数据库下载蔷薇属植物NBS类RGAs序列,共获得177条RGAs,43条序列具有完整的NBS结构域,即P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a及GLPL区,32条无P-loop和GLPL区域,102条序列无P-loop区域。结合相似性分析、聚类分析及电子定位,共筛选出21条抗白粉病候选基因序列。
3、野生型Mlo基因是大麦抗白粉病的负调控因子,该基因突变,赋予大麦对白粉菌的广谱抗性。除大麦外,在其它一些植物中也发现了一些与Mlo基因同源的基因。本文应用比较基因组学和生物信息学方法,比较从藻类到高等植物20个物种的Mlo基因的CDS序列,并对该基因的遗传多样性、氨基酸功能结构及分子系统发育进行分析。结果表明,85条基因序列共检测到57个多态位点,生成70个单元型。物种间及物种内Mlo基因存在丰富的遗传多态性;氨基酸结构域分析发现,20个物种的Mlo基因含有一段特定的Mlo结构域;其中低等植物的跨膜螺旋区域(1-5)明显比高等植物(6-8)的跨膜螺旋区域少;分子系统进化树结果显示,不同物种的聚类情况与植物学分类系统基本一致。
本研究从蔷薇属植物中共获得46条潜在NBS类白粉病抗病基因序列,为现代月季的抗白粉病育种提供基因资源。而Mlo基因的部分基因序列或其结构域,也可应用于现代月季的抗白粉病育种研究中。