促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）是下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonad，HPG)轴中的一个关键调控因子，在脊椎动物性腺发育成熟及繁殖中发挥重要作用。黄鳝（Monopterus albus）是一种雌雄同体、雌性先熟性逆转鱼类，关于性逆转的机制研究一直是鱼类生殖发育领域的重要科学问题。斑马鱼（Danio rerio）是一种重要模式生物，在性别分化时期，其性腺最初均为“卵巢样”组织，然后部分个体逐步向精巢方向分化，故其可被认为是一种幼龄雌雄同体、雌性先熟的鱼类。本研究以黄鳝和斑马鱼为研究对象，初步探讨了GnRH在性别分化中功能。研究内容主要涉及以下四个方面:　　1.在黄鳝中建立高效的TALENs基因编辑技术平台　　为深入开展黄鳝基因功能研究，本研究首次在黄鳝中建立了胚胎显微注射及TALENs基因编辑技术平台，并对黄鳝性别分化相关基因Dmrt1、Cyp19a1a和Foxl2成功进行了基因编辑，初步研究了其在黄鳝性腺分化中的功能。当在100ng/μL时，黄鳝胚胎具有较高的成活率(55.26％)和突变效率(69.56％)。采用三引物PCR方法检测黄鳝胚胎的突变效率，发现三种基因的突变效率均在50％以上，表明TALENs在黄鳝中也可以进行高效的基因编辑。黄鳝Dmrt1基因突变后，3月龄幼鱼性腺Dmrt1和Sox9a1的表达量显著降低，而Cyp19a1a和Foxl2的表达量无显著变化，血清E2、T和11-KT的含量也未受显著影响;Cyp19a1a基因突变后，Cyp19a1a和Foxl2的表达量降低，而Dmrt1和Sox9a1的表达量无显著变化，血清E2含量显著减少，而T和11-KT的含量并无显著变化;Foxl2基因突变后，Cyp19a1a和Foxl2的表达量降低，Dmrt1的表达量显著增加，血清E2的含量显著降低，T和11-KT的含量显著升高。结果表明，Foxl2可能在黄鳝早期卵巢分化发育以及性逆转中发挥着较为重要的作用。　　2.黄鳝三种GnRH的克隆与表达分析　　通过5'RACE获得黄鳝GnRH35'UTR序列，长度为332bp，与NBCI上公布的黄鳝GnRH3序列相比，发现公布的序列实际上为包含第一内含子的一个转录本。进一步克隆获得黄鳝三种GnRH的基因序列。GnRH1基因长度为703bp，四个外显子分别为:60，136，99，84bp;三个内含子分别为:114，102，108bp。GnRH2基因长度为1987bp，四个外显子分别为:134，163，84，221bp;三个内含子分别为:479，100，806bp。GnRH3基因长度为1511bp，四个外显子分别为:322，148，81，239bp;三个内含子分别为:159，205，357bp。序列相似性比较显示，黄鳝GnRH1与褐石斑鱼的相似度最高，为67％;GnRH2与斜带石斑鱼、尼罗罗非鱼和大黄鱼的相似度最高，均为86.7％;GnRH3同金头鲷和黑鲷的相似度最高，均为87.8％，说明GnRH在不同物种中的保守性较高。系统进化树结果表明，黄鳝三种GnRH分别处于不同的分支中。　　组织表达结果显示，三种GnRH在脑区中表达量较高，其它外周组织中表达量较低。在黄鳝早期胚胎发育过程中，三种GnR在出膜之前的表达量均较低，出膜之后表达量显著增加。黄鳝性逆转过程中，性腺GnRH1和GnRH3的表达量在性逆转初期显著增加，随后表达量下降;GnRH2的表达量在卵巢及间性初期表达量均较低，而在间性后期和精巢中显著提高。所以，GnRH可能参与黄鳝性逆转的调控，其中GnRH1和GnRH3可能在性逆转初期发挥作用，而GnRH2可能在精巢发育的维持中发挥功能。　　3.黄鳝GnRH2新转录本的发现及功能研究　　在黄鳝性腺中扩增获得一种包含有第二内含子的新转录本—GnRH2-nv，由于第二内含子上具有一个终止密码子而导致蛋白翻译提前终止，编码60个氨基酸的蛋白质，包含21个氨基酸的信号肽、GnRH2核心十肽以及一种新的GAP2多肽—New GAP2。组织表达分析表明，GnRH2-nv只在性腺中表达，而其它组织中检测不到。在性逆转的过程中，GnRH2-nv在卵巢中表达量较低，而在间性性腺和精巢中一直处于较高水平，暗示其可能同性逆转过程有关。　　三种多肽GAP2、New GAP2和GnRHa分别体外孵育黄鳝卵巢6h后，amh的表达量均显著高于对照组;而只有New GAP2可以显著提高sox9a1的表达。体内注射结果表明，注射GAP2后，6h后amh和foxl2的表达量显著增加，随后表达量下降;cyp19a1a的表达量只是在24h时显著增加，其它时间点未变。注射New GAP2后，6h后amh的表达量显著增加，而且维持在较高水平;注射后48h时，dmrt1a的表达量才显著增加;sox9a1在注射后6h时显著增加，约是初始时期的5倍，随后表达量恢复至初始水平。注射GnRHa后，雌雄性别分化相关基因的表达量均增加。注射GAP2后，血清T和11-KT的含量显著增加，而血清E2的含量无显著变化;注射New GAP2后的48h内，血清E2和T的含量无显著变化，而11-KT在注射后12h时显著增加，随后恢复至初始水平;注射GnRHa后，血清E2和T的含量在12h和24h时显著增加，48h恢复至初始水平，而血清11-KT的含量无显著变化。随后，采用TALENs基因编辑技术平台，在黄鳝中敲除GnRH2、GAP2和GnRH2-nv，获得P0代基因突变个体，突变效率分别为26.09％、10.41％和87.50％，为下一步开展功能研究奠定了基础。　　4.GnRH3敲除对斑马鱼生殖能力及胚胎早期PGC生成的影响　　采用CRISPR/Cas9技术，敲除斑马鱼GnRH3基因，获得缺失8bp的纯合突变体。原核表达GnRH3融合蛋白，进而制备多克隆抗体，在斑马鱼GnRH3纯合子中检测不到信号，表明GnRH3被成功敲除，编码蛋白也被破坏。GnRH3纯合子雌鱼垂体gtha和lhb的表达量显著降低，而fshb的表达量无显著变化;雄鱼垂体三种基因的表达量均无显著变化。雌性GnRH3纯合子的血清E2含量下降，但差异不显著;11-KT的含量无显著变化。雄鱼血清E2和11-KT的含量显著降低。GnRH3敲除后，雌鱼的受精率降低，但性腺指数（gonadosomatic index，GSI）和产卵量无显著变化;雄鱼的GSI和受精率也无显著变化。GnRH3突变群体中，雄性的平均比例为70.57％，而野生型为44.32％，表明GnRH3突变导致雄性比例增加，在斑马鱼性别分化中发挥功能。　　为研究GnRH3在斑马鱼性别分化中发挥作用的机制，分析了突变体及野生胚胎中PGCs数量，发现GnRH3敲除后，PGCs数量在sphere时期之前无显著变化，但随后显著低于野生型。PGCs的分子标记基因vasa和nanos3的表达量也显著降低。注射GFP-nanos13'UTR标记早期PGCs，进一步采用TUNEL检测PGCs的凋亡，GnRH3敲除并未导致PGCs凋亡的增加，表明PGCs数量的减少可能是由于PGCs的增殖受到抑制。GnRH3敲除后，斑马鱼性别分化早期阶段的12dpf、15dpf和18dpf时期，雄性性腺体细胞分化因子sox9a、amh和cyp11b的表达量增加，雌性性腺体细胞分化因子cyp19a1a的表达量下降，说明GnRH3可能通过影响PGCs的数量，进一步调控性腺体细胞相关基因的表达来影响斑马鱼早期性别分化。