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研究目的为明确前列腺素E2受体EP2(Prostaglandin E Receptor 2,EP2受体)与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展的关系,本课题利用慢病毒载体构建干扰EP2受体表达的稳定HCC细胞系,通过体外细胞功能学实验验证EP2受体对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并应用二代测序技术筛查并验证EP2受体在HCC中调控的下游信号通路。研究方法1设计并构建针对EP2受体的shRNA质粒表达载体,将重组的质粒与另外两种载体p Helper 1.0,p Helper2.0共转染293T细胞,包装生产慢病毒。2培养肝癌细胞(SK-Hep-1、SMMC-7721、MHCC97-H、HepG2、Huh7),通过Western Blot技术检测EP2受体表达情况,选出EP2受体高表达的细胞株进行后续实验。3慢病毒载体构建干扰EP2受体表达的稳定HCC细胞系,通过Western Blot及qPCR方法检测其干扰效率,并采用CCK8、细胞划痕、Transwell实验等细胞功能学实验检测EP2受体对HCC增殖、迁移及侵袭能力的影响。4分别对EP2受体干扰的MHCC97-H细胞及其对照组进行RNA数字表达谱(RNA-Seq)测序以及生物信息学分析,筛查EP2受体调控HCC的相关靶点与分子信号通路,并进行qPCR和Western Blot验证。研究结果1通过DNA测序鉴定,结果显示携带靶向沉默EP2受体基因shRNA片段的质粒构建正确,包装并生产慢病毒载体LV-shEP2。2 Western Blot结果显示:5种细胞株均表达EP2受体,MHCC97-H及HepG2细胞较其他三株表达更高,选择MHCC97-H及HepG2细胞进行后续实验。3 Western Blot及qPCR结果显示:与空白对照组和LV-ctrl组相比,感染LVshEP2的MHCC97-H及HepG2中EP2 mRNA和蛋白的表达量明显下降。4 CCK8实验中,细胞生长96h时,相比空白对照组和LV-ctrl组,感染LVshEP2的MHCC97-H及HepG2细胞的OD值明显降低(P<0.01)。5细胞划痕实验中,感染LV-shEP2后的MHCC97-H及HepG2细胞向中央迁移的能力减弱;Transwell实验中,感染LV-shEP2的MHCC97-H及HepG2细胞穿膜的细胞数明显少于空白对照组和LV-ctrl组,差异具有统计学意义(P<0.01)。6 RNA-Seq及qPCR验证结果显示:干扰MHCC97-H的EP2受体后,Wnt通路中的Wnt6、其相关受体FZD6、其下游的靶基因CCND2表达下调,通过KEGG分析得到Wnt通路。7 Western Blot结果显示:干扰MHCC97-H及HepG2细胞的EP2受体,总的β-catenin蛋白的表达无明显变化,磷酸化的β-catenin表达明显升高。研究结论1成功构建重组慢病毒表达载体LV-shEP2,具有较高的感染效率,能够稳定抑制EP2受体的表达。2 EP2受体可增强HCC细胞的迁移、侵袭和转移能力。3 EP2受体可能通过Wnt信号通路促进HCC的发生发展。