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研究背景与目的:肥胖代谢综合征是指由肥胖引起的糖脂代谢异常、胰岛素抵抗、脂肪肝等复杂代谢紊乱症候群,是糖尿病、阻塞性呼吸暂停综合征、肿瘤及心脑血管疾病等的危险诱因。人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）作为一种无伦理争议、无致瘤性、低免疫原性、多向分化潜能及强旁分泌功能的多功能干细胞在临床上具有重要的应用潜能。hAMSCs所产生的外泌体（hAMSC-exosomes）含有丰富的生物活性分子如miRNAs及蛋白分子等,相较于细胞治疗,外泌体没有成瘤风险,易于储存及实现工业化生产等。我们以往的研究发现,hAMSCs及其分泌物（hAMSCs-CM）可明显修复热水所致的皮肤损伤、显著抑制原发性肝癌细胞系诱导的肿瘤以及明显抑制高脂饮食（HFD）诱导的高糖血症,而hAMSC-exosomes中的miR-181和miR-199抑制病理性黑色素沉积。我们的前期工作也证明,hAMSCs-CM可显著抑制HFD诱导的小鼠肥胖,表现为有效减轻HFD引起的小鼠内脏脂肪肥大、糖耐量异常及肝功能损伤。但具体机制尚不清楚。hAMSCs-CM中发挥作用的活性物质如外泌体及其中的miRNA是否发挥作用尚无文献报道。因此,我们拟利用HFD诱导的小鼠肥胖模型并监测其能量代谢变化,结合hAMSC-exosomes-miRNA测序,发现及验证hAMSC-exosomes中特定miRNA对脂肪细胞成熟、分化及脂质合成代谢的影响及分子机制,同时探索hAMSC-exosomes对脂肪组织巨噬细胞极化的影响与机制,从而为肥胖的防治提供新的思路和实验依据。实验方法:1、hAMSCs和hAMSC-exosomes的制备与鉴定:1)利用胰酶结合胶原酶法消化人羊膜得到hAMSCs;2)利用RT-PCR、免疫荧光和细胞流式实验鉴定hAMSCs表面标志物;3)利用超高速离心法提取纯化exosomes;4)利用透射电镜检测外泌体的形态与大小,western blot鉴定exosomes表面标志物CD63,TSG101和HSP70的表达情况。2、整体动物水平阐明hAMSCs-CM对HFD诱导的肥胖小鼠能量代谢紊乱的影响及其信号通路:通过高脂饮食喂养15周构建小鼠肥胖模型,实验小鼠分为三组分别为正常饮食组（CHOW-D）,高脂饮食组（HFD）和高脂饮食同时给予hAMSCs-CM组（HFD-CM）。1)利用能量代谢笼检测hAMSCs-CM对肥胖小鼠二氧化碳呼出（VCO2）、氧气消耗（VO2）、饮食和饮水的影响;2)利用油红O染色、糖原染色（PAS）检测hAMSCs-CM对肝脏组织脂质累积和葡萄糖吸收情况;3)利用western blot检测脂肪组织脂质代谢相关蛋白PPARα、PGC1α和葡萄糖代谢相关蛋白GLUT4,AMPK和IGFR/AKT/GSK3β信号通路的变化,阐明hAMSCs-CM对脂质代谢和葡萄糖代谢的作用及分子机制,检测脂肪细胞IGFR蛋白变化来说明hAMSCs-CM对胰岛素敏感性的影响;4)利用免疫荧光、western blot和RT-qPCR检测hAMSCs-CM对棕色脂肪组织产热相关蛋白UCP1的变化。3、离体细胞水平阐明hAMSC-exosomes及来源于exosomes中的miR-199b-5p对脂质合成的影响:1)利用油红O染色和western blot确定hAMSC-exosomes对脂质合成的影响;2)结合外泌体miRNA测序结果,利用KEGG富集分析、GO富集分析和生物信息方法筛选出可能参与脂质合成相关的miRNAs;3)利用RT-qPCR检测白色脂肪组织、3T3L1诱导成脂肪细胞过程中miR-27a-3p和miR-199b-5p的表达情况;4)通过油红O染色观察脂肪细胞成熟情况,western blot和RT-qPCR检测脂质合成相关蛋白FAS、PPARγ、SREBP1和C/EBPα变化,说明miR-27a-3p和miR-199b-5p对脂质合成的影响;5)利用荧光双素酶报告基因实验确认miR-199b-5p靶基因GSK3β,通过油红O染色观察脂肪细胞成熟情况,western blot和RT-qPCR检测脂质合成相关蛋白FAS、PPARγ、SREBP1和C/EBPα变化,探究GSK3β抑制剂SB216763对脂质合成的影响。4、hAMSCs-CM和exosomes对HFD诱导肥胖小鼠白色脂肪炎症的影响及机制研究:1)利用免疫荧光检测脂肪组织中巨噬细胞marker F4/80的表达情况,RT-qPCR检测炎症相关蛋白ARG-1,CD206,CD11C和TNFα的转录水平,western blot检测信号通路STAT3/ARG-1的变化来探究hAMSCs-CM对白色脂肪组织炎症的影响;2)利用LPS刺激巨噬细胞RAW264.7,western blot检测炎症相关信号通路蛋白如NFκB和MAPK的变化来阐明hAMSCs-CM和hAMSC-exosomes对巨噬细胞炎症的影响。实验结果:1、hAMSCs具有间充质干细胞的特征:1)结果显示,hAMSCs呈现长梭形、成纤维细胞样,且增殖能力较强;2)RT-PCR结果显示,hAMSCs表达胚胎干细胞标记基因SOX2,Nanog和OCT4;表达间充质表面标记基因CD29,CD90,CD73,CD105;不表达造血干细胞标记基因CD34,CD133和CD45。细胞流式结果表明,hAMSCs表达间充质表面标记蛋白CD73,CD90,CD29和CD105,不表达造血干细胞标记蛋白CD34和CD45,不表达组织相容性抗原II类HLA-DR和共同刺激分子CD40,CD80,低表达组织相容性I类抗原HLA-ABC。免疫荧光结果显示,hAMSCs表达胚胎干细胞标志蛋白SSEA4和间充质细胞标志蛋白Vimentin;3)透射电镜结果显示外泌体形态完整,呈球形,直径约为50-150 nm,western blot结果显示hAMSC-exosomes表达外泌体标记物CD63,TSG101和Hsp70,不表达内质网标记物Calnexin。2、在整体动物水平,hAMSCs-CM/exosomes改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠能量代谢紊乱,其机制与其分别通过激活AMPK/PPARα和IGFR/AKT/GSK3β信号通路,进而促进脂质和糖代谢有关:1)能量代谢笼监测结果显示,hAMSCs-CM可促进HFD诱导肥胖小鼠的二氧化碳排出（VCO2）、氧气消耗（VO2）和饮水,但对饮食摄入没有影响;2)hAMSCs-CM抑制HFD诱导的肥胖小鼠肝脏组织脂质累积和促进肝脏组织对葡萄糖的吸收;3)hAMSCs-CM促进HFD诱导的肥胖小鼠白色脂肪组织、肝脏、肌肉和棕色脂肪组织中脂质代谢相关蛋白PPARα、PGC1α和葡萄糖代谢相关蛋白GLUT4的表达,其机制主要与分别激活AMPK/PPARα和IGFR/AKT信号通路来改善WAT脂质代谢和葡萄糖代谢,激活AKT/GSK3β信号通路促进肝脏葡萄糖代谢,而hAMSCs-CM和hAMSC-exosomes通过促进IGFR的磷酸化来改善脂肪细胞胰岛素敏感性;4)免疫荧光、western blot和RT-qPCR结果显示hAMSCs-CM促进HFD诱导的肥胖小鼠棕色脂肪组织产热相关蛋白UCP1的表达。3、在离体细胞水平上,hAMSC-exosomes及来源于exosomes中的miR-199b-5p通过抑制脂肪细胞分化来改善脂质合成:1)油红O染色和western blot结果显示,hAMSC-exosomes抑制3T3L1分化成成熟脂肪细胞和脂质合成相关蛋白PPARγ和C/EBPα的表达;2)HFD诱导的肥胖小鼠白色脂肪组织中miR-199b-5p和miR-27a-3p的表达低于正常饮食的小鼠,且miR-199b-5p和miR-27a-3p在3T3L1诱导成成熟脂肪细胞过程中呈现表达降低;3)油红O染色,western blot和RT-qPCR结果显示,miR-199b-5p和miR-27a-3p抑制3T3L1前体脂肪细胞向脂肪细胞分化和脂质合成相关蛋白FAS、PPARγ、SREBP1和C/EBPα的表达;4)荧光双素酶报告基因实验显示miR-199b-5p靶基因为GSK3β,油红O染色,western blot和RT-qPCR结果显示GSK3β抑制剂SB216763抑制3T3L1前体脂肪细胞向脂肪细胞分化和脂质合成相关蛋白FAS、PPARγ、SREBP1和C/EBPα的表达。4、hAMSCs-CM/exosomes通过激活STAT3/ARG-1信号通路,抑制MAPK和NFκB信号通路减轻HFD诱导肥胖小鼠白色脂肪组织的炎症:1)免疫荧光,RT-qPCR和western blot结果显示,hAMSCs-CM抑制巨噬细胞标记蛋白F4/80的表达,抑制促炎相关因子CD11C和TNFα的转录和促进抑炎相关蛋白ARG-1和CD206的转录,提示hAMSCs-CM通过激活STAT3/ARG-1信号通路减轻白色脂肪组织的炎症;2)western blot结果显示,hAMSCs-CM和hAMSC-exosomes可抑制LPS诱导RAW264.7细胞NFκB和MAPK炎症相关信号通路如IKKα/β,P65,JNK,AKT,ERK和P38的蛋白磷酸化。结论:1.本实验所用hAMSCs表达胚胎干细胞和间充质干细胞标志蛋白,不表达造血干细胞标志蛋白,且表现为低免疫原性。2.hAMSCs-CM通过激活AMPK/PPARα和IGFR/AKT/GSK3β信号通路来改善HFD诱导的肥胖小鼠能量代谢紊乱。hAMSC-exosomes来源的miR-199b-5p通过靶向GSK3β进一步抑制脂肪细胞的分化成熟。3.hAMSCs-CM/exosomes通过激活STAT3/ARG-1信号通路,抑制NFκB和MAPK信号通路来改善巨噬细胞的炎症,进而抑制HFD诱导肥胖小鼠白色脂肪组织的炎症。