论文部分内容阅读
三氯生（TCS）被普遍添加到各种药物和个人卫生护理品中，由于日常生活中的直接接触与我们的健康息息相关，其环境暴露的安全性被广泛地重视。利用模式生物斑马鱼平台已发现TCS急性/慢性暴露会导致许多与神经有关的疾病。microRNA（miRNA）作为一种参与转录后调控的小分子，在神经系统结构形成、功能完善和相关疾病的诊治方面是不可缺或的，miRNA的异常表达会诱发许多神经退行性疾病。先前的研究表明，TCS急、慢性暴露斑马鱼诱导诸多miRNAs的异常表达，多数研究注重miRNA调控的功能靶基因，但极少有报道关注引起miRNA变化的上游相关分子机制。近年来，环境因素诱导的表观遗传效应也逐渐引起关注，涉及miRNA的表观遗传调控机制亦成为新的研究热点。基于此，本文将重点讨论TCS的毒理效应中通过miRNA表观遗传修饰模式调控神经发育和髓鞘化疾病发生的互作机制。
目的：
本文旨在通过探究TCS对暴露幼鱼产生的神经相关损害的分子机制，评判TCS所致神经毒性的环境健康风险。深入分析TCS对神经系统各细胞亚群的作用形式，重点关注miR-219在神经致毒效应中的调控角色，构建miR-219效应通路中上下游调控网络，发挥生物信息学在毒理研究中的应用价值。以多物种，多层次和多组学的视角确证TCS的作用靶分子，并对其毒性效应与机制做出评估，对污染性疾病的认识、预防和治疗提供实验参考。
方法：
1.基于病理组织观察和行为学分析评价TCS所致的神经毒性效应；
2.基于NHI公共数据库利用反卷积算法寻找TCS致神经毒性效应通过影响神经系统中细胞亚群的种类，并利用流式细胞术和免疫荧光技术进行实验验证；
3.通过生物信息学手段筛选出miR-219并预测其靶基因，构建miR-219-sponge敲低转基因斑马鱼品系，借此以揭示miR-219作为目标分子的角色，阐明其在神经少突胶质细胞分化成熟中的调控作用；
4.结合RT-qPCR和W-ISH,Western-Blot和F-ICH,及双荧光素酶实验等经典的分子生物学手段，阐明miR-219的异常调控所牵动变化的标志分子，及诱发的生理功能和病理组织的损伤。并设计合成agomir/antagomir进行人工干预，借助斑马鱼神经毒性研究中的优势，以研究miR-219在TCS抑制少突胶质细胞分化作用中的变化趋势及其在少突胶质细胞分化成熟过程中所起的调控作用。
5.整合表观遗传数据，可视化pri-miR-219前体启动子区域的甲基化水平，并使用原位杂交及甲基化修饰PCR进行验证。挖掘mi-219异常表达的根源即上游机制。
结果：
（1）表型观察和行为分析数据表明，0μg/L、62.5μg/L、125μg/L、250μg/L浓度的TCS暴露对斑马鱼幼鱼产生致畸表型和中枢神经系统的结构损伤，神经运动能力、应激反射能力和昼夜节律异常均呈浓度梯度依赖性加重，初步表明TCS对斑马鱼具有神经毒性效应。
（2）反卷积计算数据分析及实验验证表明，随着TCS梯度浓度升高，幼鱼少突胶质细胞停留在前体细胞阶段（OPC）的比例逐渐升高，表明TCS通过抑制少突胶质细胞的分化成熟而致神经毒性效应。
（3）miRNA的高通量测序结果显示miR-219在TCS作用下呈下调变化趋势，且在孵化后2-3dpf是TCS作用变化的敏感期。且通过功能预测和实验验证均表明miR-219在OPC分化中的起着关键的调控作用。分子水平的检测发现miR-219的吸附敲降致斑马鱼的表观畸形和行为异常表现与梯度浓度的TCS暴露对斑马鱼幼鱼神经发育和功能的影响完全一致，这反过来也证实了TCS暴露下的miR-219表达是下降的，其下调是致神经毒性的分子机制之一。
（4）通过合成miR-219化学修饰的反义寡核苷酸探针antagomir&agomir进行敲将和过表达的功能干预，测试表明，miR-219通过靶向作用于3个髓鞘形成抑制基因Lingo1b、Etv5a和Nfia从而促进了OPC的分化，通过其种子序列与目标靶基因3’-UTR结合序列双荧光素酶报告系统的构建，实验证实Lingo1b、Etv5a和Nfia为miR-219的调控靶基因，miR-219在转录水平mRNA和蛋白表达水平的变化也是一致的。
（5）过表达miR-219，少突胶质细胞成熟的标志基因表达上升，前体细胞标志基因表达下调，促进前体细胞的分化和成熟，行为学表现也与相关分子变化的生理功能相吻合。回补miR-219能弥补TCS暴露下miR-219下调对少突胶质细胞成熟的抑制，而是促进成熟标志基因上升，前体细胞标志基因表达下调，行为学表现也得到显著改善，因此认为TCS靶向的miR-219是脱髓鞘疾病的治疗靶分子。
（6）由于miR-219有三个前体pri-mir-219-1,pri-mir-219-2和pri-mir-2193，转录水平上的原位杂交实验证实miR-219成熟体主要来源于pri-mir-219-2前体。通过对前体转录启动区的表观遗传学数据分析miR-219上游启动子序列特征，发现在miR-219上游启动子区存在多处CpG岛，且随着TCS浓度梯度的增加，5个已鉴定的CpG岛的甲基化修饰程度显著增加，这表明TCS通过调控提高miR-219前体启动子区的甲基化程度靶向miR-219的下调是其神经致毒效应的机制之一。
结论：
（1）本研究基于TCS造成的表观畸形、病理损伤及行为异常得到的数据评估了三氯生的环境暴露造成脱髓鞘化神经毒性效应的健康风险。
（2）进一步地结合生物信息学以及实验验证的方式，确认了TCS对中枢神经系统的致毒效应是通过抑制少突胶质细胞的成熟分化造成的，即是TCS诱导神经发育毒性（DNT）的机制。
（3）进一步整合miRs高通量测序及芯片结果，揭示了miR-219对髓鞘分化包裹所起的作用。miR-219敲降的斑马鱼幼鱼表观表现与TCS暴露的幼鱼具有相似的表型，这一结果加深了miR-219功能推断的可靠性。通过生物信息学分析和敲降及过表达实验验证均证实了miR-219具有正向调控少突胶质前体细胞的成熟分化。
（4）多种表观遗传效应和最终的甲基化修饰PCR证实，发现pri-miR-219-2启动子区域的CpG岛的存在是TCS调控miR-219表达的作用靶点，即DNA甲基化程度的升高是TCS靶向miR-219分子下调的主要模式，miR-219的异常变化导致髓鞘化标志基因的表达变化从而诱发神经毒性效应。这些发现增进了我们从miRNA前体的表观遗传学的角度认识TCS引起脱髓鞘疾病的新机制，为污染件疾病的早期预防、精准干预和基因靶向治疗提供了理论指导。
目的：
本文旨在通过探究TCS对暴露幼鱼产生的神经相关损害的分子机制，评判TCS所致神经毒性的环境健康风险。深入分析TCS对神经系统各细胞亚群的作用形式，重点关注miR-219在神经致毒效应中的调控角色，构建miR-219效应通路中上下游调控网络，发挥生物信息学在毒理研究中的应用价值。以多物种，多层次和多组学的视角确证TCS的作用靶分子，并对其毒性效应与机制做出评估，对污染性疾病的认识、预防和治疗提供实验参考。
方法：
1.基于病理组织观察和行为学分析评价TCS所致的神经毒性效应；
2.基于NHI公共数据库利用反卷积算法寻找TCS致神经毒性效应通过影响神经系统中细胞亚群的种类，并利用流式细胞术和免疫荧光技术进行实验验证；
3.通过生物信息学手段筛选出miR-219并预测其靶基因，构建miR-219-sponge敲低转基因斑马鱼品系，借此以揭示miR-219作为目标分子的角色，阐明其在神经少突胶质细胞分化成熟中的调控作用；
4.结合RT-qPCR和W-ISH,Western-Blot和F-ICH,及双荧光素酶实验等经典的分子生物学手段，阐明miR-219的异常调控所牵动变化的标志分子，及诱发的生理功能和病理组织的损伤。并设计合成agomir/antagomir进行人工干预，借助斑马鱼神经毒性研究中的优势，以研究miR-219在TCS抑制少突胶质细胞分化作用中的变化趋势及其在少突胶质细胞分化成熟过程中所起的调控作用。
5.整合表观遗传数据，可视化pri-miR-219前体启动子区域的甲基化水平，并使用原位杂交及甲基化修饰PCR进行验证。挖掘mi-219异常表达的根源即上游机制。
结果：
（1）表型观察和行为分析数据表明，0μg/L、62.5μg/L、125μg/L、250μg/L浓度的TCS暴露对斑马鱼幼鱼产生致畸表型和中枢神经系统的结构损伤，神经运动能力、应激反射能力和昼夜节律异常均呈浓度梯度依赖性加重，初步表明TCS对斑马鱼具有神经毒性效应。
（2）反卷积计算数据分析及实验验证表明，随着TCS梯度浓度升高，幼鱼少突胶质细胞停留在前体细胞阶段（OPC）的比例逐渐升高，表明TCS通过抑制少突胶质细胞的分化成熟而致神经毒性效应。
（3）miRNA的高通量测序结果显示miR-219在TCS作用下呈下调变化趋势，且在孵化后2-3dpf是TCS作用变化的敏感期。且通过功能预测和实验验证均表明miR-219在OPC分化中的起着关键的调控作用。分子水平的检测发现miR-219的吸附敲降致斑马鱼的表观畸形和行为异常表现与梯度浓度的TCS暴露对斑马鱼幼鱼神经发育和功能的影响完全一致，这反过来也证实了TCS暴露下的miR-219表达是下降的，其下调是致神经毒性的分子机制之一。
（4）通过合成miR-219化学修饰的反义寡核苷酸探针antagomir&agomir进行敲将和过表达的功能干预，测试表明，miR-219通过靶向作用于3个髓鞘形成抑制基因Lingo1b、Etv5a和Nfia从而促进了OPC的分化，通过其种子序列与目标靶基因3’-UTR结合序列双荧光素酶报告系统的构建，实验证实Lingo1b、Etv5a和Nfia为miR-219的调控靶基因，miR-219在转录水平mRNA和蛋白表达水平的变化也是一致的。
（5）过表达miR-219，少突胶质细胞成熟的标志基因表达上升，前体细胞标志基因表达下调，促进前体细胞的分化和成熟，行为学表现也与相关分子变化的生理功能相吻合。回补miR-219能弥补TCS暴露下miR-219下调对少突胶质细胞成熟的抑制，而是促进成熟标志基因上升，前体细胞标志基因表达下调，行为学表现也得到显著改善，因此认为TCS靶向的miR-219是脱髓鞘疾病的治疗靶分子。
（6）由于miR-219有三个前体pri-mir-219-1,pri-mir-219-2和pri-mir-2193，转录水平上的原位杂交实验证实miR-219成熟体主要来源于pri-mir-219-2前体。通过对前体转录启动区的表观遗传学数据分析miR-219上游启动子序列特征，发现在miR-219上游启动子区存在多处CpG岛，且随着TCS浓度梯度的增加，5个已鉴定的CpG岛的甲基化修饰程度显著增加，这表明TCS通过调控提高miR-219前体启动子区的甲基化程度靶向miR-219的下调是其神经致毒效应的机制之一。
结论：
（1）本研究基于TCS造成的表观畸形、病理损伤及行为异常得到的数据评估了三氯生的环境暴露造成脱髓鞘化神经毒性效应的健康风险。
（2）进一步地结合生物信息学以及实验验证的方式，确认了TCS对中枢神经系统的致毒效应是通过抑制少突胶质细胞的成熟分化造成的，即是TCS诱导神经发育毒性（DNT）的机制。
（3）进一步整合miRs高通量测序及芯片结果，揭示了miR-219对髓鞘分化包裹所起的作用。miR-219敲降的斑马鱼幼鱼表观表现与TCS暴露的幼鱼具有相似的表型，这一结果加深了miR-219功能推断的可靠性。通过生物信息学分析和敲降及过表达实验验证均证实了miR-219具有正向调控少突胶质前体细胞的成熟分化。
（4）多种表观遗传效应和最终的甲基化修饰PCR证实，发现pri-miR-219-2启动子区域的CpG岛的存在是TCS调控miR-219表达的作用靶点，即DNA甲基化程度的升高是TCS靶向miR-219分子下调的主要模式，miR-219的异常变化导致髓鞘化标志基因的表达变化从而诱发神经毒性效应。这些发现增进了我们从miRNA前体的表观遗传学的角度认识TCS引起脱髓鞘疾病的新机制，为污染件疾病的早期预防、精准干预和基因靶向治疗提供了理论指导。