据世界卫生组织统计,全球每年肺癌新发病例超过120万,其中非小细胞肺癌发病率较高,超过1叭万多例。在中国每年新发癌症280万,肺癌居首。肺癌死亡率在过去30年中,从5.46／10万增长到30.83／10万,常见恶性肿瘤死因中排第1位。目前肺癌年平均存活率仅12%,其术后转移复发率高,是限制临床治疗的最大难题,故非小细胞肺癌侵袭转移的机理及综合防治措施一直是研究重点。侵袭和转移是非小细胞肺癌的最本质生物学特征,越来越多的证据提示,包括非小细胞肺癌在内的肿瘤侵袭转移是一个多因素、多阶段、多环节、逐渐发展的复杂动态过程,不仅涉及癌细胞本身多种基因的异常表达及多条信号通路的激活,也涉及癌细胞与间质微环境的相互作用,即肿瘤间质微环境。但间质微环境内成分众多,功能各异,作用悬殊,单纯的分子、细胞水平研究或者是临床整体水平均无法准确反映癌细胞与间质微环境的相互作用。在组织学水平,可以观察到大多数的分子和细胞事件,以及组织结构变化,反映癌细胞和问质微环境协同进化的全景图。但目前尚缺乏合适的研究技术显示其演变特征。量子点具有优良的光电特征,如发射波大小、成分可调、荧光强度高、耐光性漂白性好,是分子成像领域重要的材料基础,在生物成像、分子标记领域已经显示出良好的应用前景。多光谱成像分析技术与光学成像技术的定位特点融合,可以提供分析试样中各种化学或生化成分的分布图,获得定性、定量和定位的分析信息。因此,基于量子点标记分子探针的多光谱成像分析技术,有望突破技术壁垒,在保证高灵敏度和高特异度的条件下,同时显示肿瘤间质微环境内的多种成分。本课题从临床肿瘤学问题出发,针对肿瘤间质微环境的关键因子在非小细胞肺癌侵袭转移过程中的特征及作用这一关键科学问题,充分发挥量子点标记分子探针应用领域的独特优势,利用量子点标记分子探针结合多光谱分析技术,建立适合于肿瘤间质微环境研究的量子点标记分子探针多光谱成像分析技术,实现多分子的原位、实时、共成像技术及肿瘤间质微环境信息的提取、挖掘和分析。在此基础上深入研究非小细胞肺癌进展过程的间质微环境特征,分析癌细胞与各关键肿瘤分子及间质微环境中关键因子的协同进化作用,在充实肿瘤微环境理论的同时,提出了使用量子点标记分子探针技术联合检测肿瘤相关蛋白与间质微环境的关键因子特征作为非小细胞肺癌预后指标的发展方向及相关综合分析策略。为进一步拓展非小细胞肺癌侵袭转移研究奠定基础,促进基础成果的转化。本研究主要包括3个部分：第一部分：基于量子点探针技术在NSCLC中标记分子蛋白的初步应用研究目的：利用新型半导体免疫荧光标记试剂—量子点(QDs)结合组织芯片技术检测癌胚抗原(CEA)、角蛋白19(CK19)、VEGF及P53蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达,并与免疫组织化学法对比,探讨量子点免疫荧光技术的简便性、可行性和实用性。方法：利用量子点免疫荧光组织化学(QDs-IHC)技术分别检测CEA、CK19片段、VEGF及P53的蛋白表达,同时检测CEA与CK19的共表达,并与传统免疫组化法的结果对比。结果：实验组(癌组织)CEA、CK19片段蛋白表达与(非癌组织的对照组比较,存在差异(P<0.01),与肺癌的年龄、性别、组织学类型和临床分期之间及是否伴有淋巴结转移无相关性(P>0.05)。实验组VEGF与对照组比较存在差异(P<0.05),与肺癌的年龄、性别、不同组织学类型和临床分期之间无相关性(P>0.05),与伴有淋巴结转移的肺癌呈正相关(P<0.05)。而实验组P53与对照组比较无明显差异(P>0.05),与肺癌的年龄、性别、不同组织学类型和临床分期之间无相关性(P>0.05),P53蛋白与伴有淋巴结转移的肺癌呈正相关(P<0.05)。 QDs-IHC与IHC检测4种蛋白表达的阳性率结果比较不存在差异(P>0.05)。结论：QDs-IHC检测的背景更干净,假阳性率低,而2种方法学的检测的结果无差异(P>0.05),而且QDs-IHC可同时检测2种或3种分子蛋白更节省样本,也具有实用性。第二部分：基于量子点标记分子探针技术的肿瘤相关蛋白分子与间质微环境中关键因子的同时成像及相关性研究目的：建立一种稳定、可靠地原位、实时、共定位、多分子成像及定量分析技术体系,研究肿瘤相关蛋白分子与间质微环境中关键因子的同时成像及相关性。方法：利用量子点标记分子探针和多光谱成像分析技术,建立针对肿瘤间质微环境的多色成像方法,实现非小细胞肺癌间质微环境的分子成像；多参数、多维度定量分析四种肿瘤蛋白分子(CEA、CK19片段、VEGF及P53)表达之间的相关性,并同时检测CEA与CK19的共表达。结果：97例非小细胞肺癌组织中,CK19片段和CEA蛋白共表达阳性有81例,共表达阴性为4例,二者之间存在正相关(P<0.01,r=0.358),提示彼此可能协同促进肺癌的侵袭转移。而其余三种肿瘤相关蛋白之间无相关性。同时也证明QDS-IHC可同时检测2种,甚至3种及以上的分子蛋白。这种方法更节省样本,也具有实用性,也为后续研究提供了方法依据。结论：本研究建立了适合于肿瘤间质微环境研究的量子点标记分子探针多光谱成像分析技术体系,具备原位、实时、共定位、多分子成像及多光谱定量分析等优势、能在敏感度高、特异性强的前提下,同时显示肿瘤相关蛋白分子及间质微环境内多种成分的变化。第三部分：基于量子点标记分子探针技术的非小细胞肺癌细胞及间质微环境协同进化研究目的：研究非小细胞肺癌细胞与其间质微环境之间的协同进化关系,深化对NSCLC侵袭转移过程中微环境基本变化规律的认识。方法：构建包含97例NSCLC组织的组织芯片,利用已经建立的量子点标记分子探针多光谱成像分析技术体系,从形态学及统计学分析癌细胞与间质微环境及肿瘤中多种肿瘤相关蛋白分子在肿瘤侵袭和转移中的协同进化作用,研究间质微环境特征和NSCLC预后的关系。结果：以癌巢基底膜主要成分ⅣV型胶原为研究对象,通过研究肿瘤进展过程中癌细胞和肿瘤间质微环境的空间特征显示该技术稳定可靠,普遍使用,较好的呈现了侵袭过程中的结构变化和分子变化,能定性定量显示ⅣV型胶原的连续性、平滑性、完整性及其厚薄程度。在此基础上,发现了NSCLC侵袭的四种新型模式,包括冲刷型、阿米巴型、极向型和线型。这四种侵袭模式从空间结构变化角度反应了癌细胞与间质微环境的协同进化过程,充实了肿瘤侵袭理论,也开阔了量子点标记分子探针在肿瘤研究领域的发展方向。并利用量子点标记分子探针双彩色成像技术为基础,同时标记ECM中的ⅣV型胶原和VEGF,从而为研究非小细胞肺癌侵袭期间,VEGF阳性时ECM降解的动态变化提供平台。结论：量子点标记分子探针多光谱成像分析技术是研究肿瘤间质微环境的有效方法,为阐明肿瘤间质微环境在侵袭转移的作用提供了新的实验依据,即癌症进展各阶段具有独特的ECM降解特征。