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蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)是我国大宗低值鱼资源的重要品种之一,由于其色暗和容易氧化而被有限使用,一般用于制成肥料和动物饲料,有些甚至直接丢弃,造成了极大的资源浪费。本文以蓝圆鲹为对象,采用生物酶解、抗氧化实验、螯合、凝胶色谱、反相高效液相色谱和质谱等方法,系统的研究了酶解工艺的主要参数、酶解物体内体外抗氧化活性、螯合对酶解物稳定性的影响、抗氧化肽的分离纯化和结构表征,为开发蓝圆鲹抗氧化肽功能性产品提供理论依据。主要结果如下: 1.以蓝圆鲹蛋白为底物,分别用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase在各自适宜条件下进行酶解,比较酶解物的水解度、蛋白回收率和自由基清除率。结果表明蓝圆鲹鱼肉蛋白在中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用下,其水解度、蛋白回收率和自由基清除率较高;在此基础上用复合酶解新技术对蓝圆鲹鱼肉进行水解研究。以水解度、蛋白回收率、自由基清除率为指标,最终确定复合酶解蓝圆鲹鱼肉蛋白制备多肽的最佳工艺条件为:在水料比1:2、pH为7.5、温度50℃、酶总量为0.3%且酶配比为1:1条件下,酶解方式为中性蛋白酶和胰蛋白酶同时加入,酶解时间为5h;该条件下制备的鱼肉蛋白酶解产物水解度和蛋白质回收率分别为25.86%、75.24%,还原力为0.452,DPPH·和OH·半清除率分别为6.38mg/mL和14.45mg/mL。 2.以蓝圆鲹酶解物和金属离子为原料合成金属螯合物,采用火焰原子吸收分光光度法,对螯合条件(质量比,反应温度,反应时间及 pH)进行了研究。确定最佳螯合条件为:以抗氧化肽:盐质量比15:1,pH为7在40℃下反应40min;该条件下得出的螯合物具有较高的螯合率。且酶解物与三种金属离子螯合产物中,钙离子螯合物抗氧化效果最好。选择抗氧化性较好的钙离子螯合物做稳定性分析,比较不同储藏方式、热处理、pH及模拟消化道环境对螯合物和酶解物的抗氧化稳定性的影响,该条件下制备的金属螯合抗氧化肽具有较弱的耐热性和较强的耐酸耐碱性,低温条件下储藏有利于保持其抗氧化活性。 3.探究了不同分子量的蓝圆鲹蛋白酶解物的抗氧化活性,酶解物用三种不同的超滤膜(MW50,10 and5 kDa)分成四个组分(RSPH-I,RSH-II,RSPH-III,RSPH-IV)。各组分显示出不同的抗氧化活性,其中小于5 kDa(RSPH-IV)组分抗氧化活性最强。采用Sephadex G-25凝胶色谱法将RSPH-IV分成四个组分(A,B,C,D),并分别检测各组分的还原力和自由基清除率,最后筛出B为抗氧化能力最高的部分,其余三组分的抗氧化能力依次为 C>D>A.并对组分 B进行分子量分布分析,发现该肽段的相对分子量主要集中在335到1062 kDa.随后采用制备柱RP-HPLC将B分成6个组分(B1,B2,B3,B4,B5,B6),以自由基捕获率为指标筛选出具有较强抗氧化活性的组分 B3,经 RP-HPLC纯度鉴定为单一峰;通过Orbitrap-LC-MS二级质谱,鉴定出组分B2的相对分子量对506 Da,氨基酸序列为KGFR(Lys-Gly-Phe-Arg)。DPPH、羟自由基半清除率(IC50)为0.126 mg/mL和1.48 mg/mL,还原力为0.545。