作为临床常见病多发病,肿瘤一直是以其难以治愈而困扰医学界,恶性肿瘤一经发现,即使采取任何治疗措施,其死亡率仍然很高,目前除了少数恶性程度较低的肿瘤以外,大多数恶性肿瘤仍然是处于无法治愈的状态,所以肿瘤的死亡率与其发病率相比较而言,比例高的令人难以接受,这也造成了整个人类世界谈癌色变,所以恶性肿瘤目前成为了医学界最大的难题,由于其难以预防,难以发现,难以治疗仍然困扰着医生和患者,威胁着人类社会的安全。临床对肿瘤的治疗手段一般都是手术切除,然后辅以放射线治疗,最后按照疗程进行化学药物治疗,但是这些传统手段对患者损伤极大,而且仍然存在存活率低,复发性强的危险,于是在所有的治疗方法结束后,国内的肿瘤科医生一般建议患者去看中医。中医治疗的优点是毒副作用小,但是多年来中医一直倡导辩证施治,从阴阳五行论述自己的观点,因为缺乏足够的分子生物学理论基础而不被众多西医学者认可。本研究采用小白菊内酯作为试验药物,并且采用多种试验方法,包括形态学,分子生物学等角度,对小白菊内酯的抗肿瘤作用进行详细的研究和深入的探讨,以期开发出新的抗肿瘤药物,并且能够投入到临床应用,从而减轻患者的治疗痛苦并且达到抗肿瘤新药的开发目的。小白菊产于我国浙江省桐乡,是南方人饮茶时放入的佐料,提高茶的口感,同时对其中药特性的简单应用。其主要的药用部分为小白菊内酯(parthenolid,PTN),属于倍半萜内酯,是墨西哥、印度等应用小白菊时的药用的植物活性成分。随着中药抗肿瘤研究的深入,对小白菊进行研究的学者越来越多,对小白菊的各种功效的探讨已经逐步完善。本实验通过小白菊内酯对B16细胞的抑制机制探讨,旨在阐明小白菊内酯的抗肿瘤作用机理。本研究首先采用MTT法检测了小白菊内酯体外对肿瘤细胞的抑制增殖作用,通过免疫细胞化学方法检测了小白菊内酯对B16细胞中Bcl-2、fas、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3基因蛋白的表达变化;应用HE染色、AO/EB染色、Hochest染色等方法对小白菊内酯作用于恶性肿瘤细胞B16细胞株后形态学的改变进行了观察;应用PI染色法通过流式细胞仪检测了小白菊内酯引起的凋亡作用以及细胞周期的变化;应用PCR方法检测了凋亡通路及增殖的相关基因P65、CyclinDl、Ki-67mRNA表达,应用Western Blotting方法检测了细胞周期相关蛋白和凋亡通路相关蛋白P53、Bax、P65、CyclinD1、Ki-67表达的变化。通过实验,希望能够阐明小白菊内酯对黑色素瘤B16细胞抑制作用的机理,争取为小白菊内酯抗肿瘤作用的开发提供足够的理论依据。主要方法和结果:1、MTT比色法检测对肿瘤细胞的抑制增殖作用MTT结果显示小白菊内酯对小鼠黑色素瘤B-16细胞株有明显抑制增殖作用。2、HE染色应用HE染色、我们观察到了对照组细胞贴壁生长良好,经小白菊内酯处理后细胞变圆,贴壁不牢固,细胞生长明显受到抑制。3、AO/EB染色结果显示活细胞染色质被染成绿色,但是呈现正常结构,早期凋亡细胞染色质被染成绿色,但是胞核边缘不整齐,呈皱缩状态。晚期凋亡细胞核染色质被EB染成橘红色,并且呈皱缩状态,本实验中小白菊内酯处理组橘红色细胞同对照组比较明显增多。4、Hochest染色小白菊内酯处理后的小鼠黑色素瘤B16细胞株出现明显的凋亡状态,细胞DNA结合Hochest后,紫外光激发时发射明显的蓝色荧光。细胞核边缘可出现皱褶或折缝样外观。一些细胞染色质出现凝聚边缘化状态。5、流式细胞术检测结果我们用酒精处理细胞PI染色,结果显示小白菊内酯能够改变B16细胞周期分布。24h时对照组G0/G1期细胞占51.07%,G2/M期细胞占10.24%,S期细胞占37.82%;而小白菊内酯组G0/G1期细胞明显增多,为71.22%,G2/M期和S期细胞百分比分别为8.36%和19.09%。对照组和实验组相比较均有统计学意义(P<0.05)。可以看出小白菊内酯能够改变细胞周期的分布,使G1期细胞的百分比明显增高,S和G2期细胞明显降低,干预了细胞增殖。而凋亡检测结果显示,小白菊内酯处理组细胞凋亡指数明显高于对照组,二者比较有显著差异;同时发现小白菊内酯作用24h后,实验组的凋亡指数明显增加,增殖指数明显下降,说明小白菊内酯能够很好地抑制B16细胞增殖,并且诱导细胞凋亡,实验组和对照组相比较有统计学意义(P<0.01)。6、RT—PCR 结果P65、cyclinD1、Ki-67mRNA在Oh组的表达都处于较高水平,小白菊内酯作用于B16细胞后24h,B16细胞内的P65、cyclinD1、Ki-67mRNA水平明显降低,与未经小白菊内酯处理(0h)相比,有显著性差异(P<0.05)。7、免疫细胞化学染色检测我们通过免疫细胞化学检测方法检测了小白菊内酯对B16细胞中的Bcl-2、fas、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3表达变化,发现它的表达水平发生了明显的改变。利用公式计算出了蛋白阳性表达率,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明小白菊内酯能够降低了 B16细胞中bcl-2蛋白的表达,同时能够提高 fas、Caspase-9、Caspase-8 和 Caspase-3 的表达。8、Western Bloting实验我们通过Western Bloting方法检测了P53、Bax、P65、cyclinD1、Ki-67等蛋白的表达变化。发现了小白菊内酯明显上调P53、Bax、下调了P65、cyclinD1、Ki-67的表达水平,实验组和对照组相比较有显著差异(P<0.01)。研究结论:1.小白菊内酯对小鼠黑色素瘤B16细胞具有抗增殖作用,其过程可能是通过抑制cyclinD1和Ki-67的表达来完成。2.小白菊内酯能诱导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡,其作用可能是通过影响Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3的表达,从而通过线粒体途径引起细胞凋亡。3.小白菊内酯对小鼠黑色素瘤B16肿瘤细胞的诱导凋亡作用也可以是通过影响Caspase-8和Caspase-3的表达,通过死亡受体途径来完成。4.小白菊内酯对B16细胞的诱导凋亡作用可能与细胞周期发生G1/S期阻滞有关。5.小白菊内酯有望开发成一种新的抗肿瘤药物。