木聚糖作为一种多聚五碳糖,存在于几乎所有植物的细胞壁中,是半纤维素的主要组分,自然界中第二大可再生资源。木聚糖的水解需要木聚糖酶的参与,内切β-1,4-木聚糖酶最为关键,在造纸、饲料、食品、生物质能源开发中有着极大的应用前景,因此,开发新的木聚糖酶,获得高产木聚糖酶的基因工程菌,低成本生产木聚糖酶具有重要的意义。本论文前期研究通过鸟枪法克隆到短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)HBP8的木聚糖酶基因xynHB,在毕赤酵母中进行了表达,SDS-PAGE结果显示该基因的毕赤酵母表达产物由于糖基化产生大小分别为32.2 kDa和29.6 kDa两条蛋白条带。酶学性质研究显示,该酶最适pH为6-9,最适反应温度为40-60℃,然而该蛋白在60℃下热稳定性较差,半衰期仅有12 min,随后通过定点诱变的方法,将该木聚糖酶的第三个糖基化位点第187位的N突变成A,意外得到热稳定性显著提高的突变体。本研究在此基础上包括两个部分,一是利用rDNA介导的表达将该木聚糖酶在酿酒酵母表达,开发可用于面包烘焙行业的木聚糖酶;二是通过密码优化和基因剂量效应构建木聚糖酶在毕赤酵母表达的高产菌株,获得可用于纸浆助漂的木聚糖酶。具体研究结果如下:1、木聚糖酶基因xynHB在酿酒酵母中的表达和在面包烘焙中的应用。由于毕赤酵母不是FDA认证的GRAS生物,不能用于食品行业,而酿酒酵母是GRAS,而且长期应用于食品行业。因此本研究将该木聚糖酶基因在酿酒酵母表达,利用实验室前期构建的一个rDNA介导的酿酒酵母表达载体pHBM367H,期望通过基因剂量效应,获得一个高产菌株。首先构建rDNA介导的酿酒酵母表达质粒pHBM367H-xynHB,转化酿酒酵母INV-Sc1感受态细胞,筛选获得一株水解圈最大的菌株A13,分别在SC培养基和YEPD培养基诱导72h和48h表达活性达到最大,分别为2.5 U/mL和11.2 U/mL。SDS-PAGE与活性电泳分析显示大约在29 kDa和36 kDa处出现两条活性条带。通过实时荧光定量RT-PCR计算A13菌株整合木聚糖酶基因的拷贝数为13.64,将该菌株经过大约106代细胞传代培养,传代细胞木聚糖酶表达活性较初代无明显变化,说明该菌株具备优良的传代稳定性。将该酿酒酵母表达的木聚糖酶XynHB当做食品添加剂添加到面包中,以全麦面粉为原料,当木聚糖酶的添加量为1,200 ppm时,能显著减少面团的打面时间,增加面团的体积,同时成品面包的体积、弹性、剖面结构、外壳和形状等各项属性均优于对照。2、木聚糖酶毕赤酵母高产菌株的构建本研究在木聚糖酶突变体基因xynHBN187A的基础上,按照在毕赤酵母表达的密码偏爱性进行序列优化,通过DNAworks软件,获取优化基因序列xynHBs及其引物序列,采用实验室常规的PCR重叠引物延伸的方法获得优化序列xynHBs全长。随后构建毕赤酵母分泌型表达质粒pHBM905A-xynHBs,将重组表达质粒经限制性内切酶Sal I线性化回收后,电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,分别筛选单拷贝转化子,摇瓶发酵,结果含有优化序列xynHBs的重组菌株比含有原始序列xynHB的重组菌株木聚糖酶表达活性大幅提高39.5%,表达活性由650 U/mL提高到907 U/mL。随后大量转化pHBM905A-xynHB,获得几千个GS115/pHBM905A-xynHBs的转化子,利用底物平板法从中筛选到一株高表达重组菌株Y16,通过摇瓶发酵,测得其木聚糖酶表达活性超过6,000 U/mL。通过实时荧光定量RT-PCR测得Y16菌株的拷贝数为9。