食品微生物是影响食品安全的重要因素，由食源性致病菌引起的病例越来越多。致病菌往往共存于复杂的生物体系中，且个体微小、致病性高，因此，微生物检测方法必须要高灵敏度、强特异性以及较短的分析时间。传统的培养法，需要3~7天的时间，操作繁琐，所用试剂复杂多样，无法对微生物进行实时而有效的监测和防控；而基于DNA水平的普通聚合酶链式反应（PCR）检测技术，虽然具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点，但却无法区分死、活细菌，使得检测结果与现行的致病菌检测标准不一致，故普通PCR法只能用来对已经分离培养的致病菌进行快速鉴定，而不能对样品中的致病菌进行直接检测。因此，建立一套快速、灵敏又能区分死、活菌的检测方法，尤为重要。　　本研究选取食品中代表性的致病菌，即革兰阴性沙门菌(Salmonella)和革兰阳性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分别以沙门氏菌invAmRNA与金黄色葡萄球菌femA mRNA为检测对象，建立了一套Taqman探针一步实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法，主要有以下结论：　　1)该一步RT-PCR测法，活菌的检测结果显阳性，死菌的检测结果呈现阴性，能够有效的区分死、活菌；　　是否为阳性样本还可采用以下方法判定：　　若同一样本RT-PCR的扩增Ct值与PCR的扩增Ct值相差大于等于4，则该样本为阳性；若二者的Ct差值小于4，那么使用DNaseI再消化一次，如果再次消化后，二者的Ct差值大于等于4，那么该样本为阳性，反之则为阴性；　　2)菌液在4℃的环境保存时，细菌的代谢活性会减弱，mRNA的表达量会下降，在进行RT-PCR检测时，应预先活化菌液；最佳增菌方式为：50μL菌液添加到3mLLB液体培养基中，200rpm、37℃震荡培养3h；　　3)离心柱式试剂盒法所提取的RNA能够用于RT-PCR对活菌的检测，而传统TrizolRNA提取法所提取的RNA不适用于RT-PCR对活菌的检测；　　4)一步法与两步法RT-PCR在检测结果的Ct值上，没有较为明显的差异，但一步法耗时短，易于操作，检测成本低，更适合于食源性致病菌的快速检测；　　5)DNA会干扰RT-PCR对mRNA的检测，RT-PCR检测时，需使用DNaseI除去RNA抽提液中残留的DNA，才能有效的区分死、活菌；两次DNaseI的使用几乎能去除所有的残留DNA，是否需再次使用DNaseI的判定方法：在经RT-PCR扩增后，活菌与死菌的Ct值相差大于等于4时，可认为两者的Ct值存在差异，可再次使用DNaseI消化提取液；否则，重新实验；　　6)探针、引物是影响RT-PCR检测的重要因素，将直接影响RT-PCR的定量结果；本文自设计的femA引物、探针具有高度的特异性，其RT-PCR扩增产物序列与金黄色葡萄球菌femA基因序列同源，相似性达100％；在DNA定量的准确性上已经接近市售标准试剂盒水平，在灵敏度上已高于市售试剂盒；该引物、探针可用于普通试剂盒的生产；　　7)该一步RT-PCR检测法稳定性良好，能够检测到处于VBNC状态下的沙门氏菌，具有较强区分死、活菌的能力；在检出限、灵敏度上均优于现行国家商检标准；沙门氏菌：灵敏度为4×103CFU/mL，检出限可达1CFU/3mL；最佳扩增参数为：45℃×10min；95℃×15min；94℃×20s，60℃×20s，72℃×20s，40cycles；单点荧光在72℃；选用FAM通道检测；金黄色葡萄球菌：灵敏度为9×102CFU/mL，检出限可达1/3CFU/3mL；最佳扩增参数为：45℃×10min；95℃×15min；94℃×20s，55℃×20s，72℃×30s，40cycles；单点荧光在72℃；选用FAM通道检测。　　本论文所建立的一步实时RT-PCR检测法快速、灵敏、特异性强，而且能够准确的定量活菌，随着研究的深入，该检测法可推广应用到其它致病菌的检测中，建立一种能够同时食品中检测多种致病菌的多重实时RT-PCR。