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第一部分蛋白酶激活受体-1，2在小鼠急性GVHD模型中的表达目的：急性GVHD的机制仍不明确，但已经公认供者T淋巴细胞的激活和炎症细胞因子的释放发挥了重要的作用。最近的研究提示PAR不仅能降解细胞内蛋白酶，还是炎症和免疫过程中的重要信号分子。本研究的目的是探讨蛋白酶激活受体-1，2(PAR-1，2)在小鼠急性移植物抗宿主病(GVHD)模型中的表达。方法：建立异基因造血干细胞移植(HSCT)后小鼠急性GVHD模型，同基因HSCT小鼠作为对照组。观察小鼠急性GVHD临床表现，组织切片HE染色观察小鼠GVHD的病理改变。实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学方法检测PAR-1，2在基因和蛋白水平的表达。结果：异基因HSCT小鼠在+18～+28天出现了典型的急性GVHD征象和病理表现。实时定量PCR结果显示：PAR-1基因在异基因HSCT组小鼠的急性GVHD靶器官——皮肤、肝脏、小肠中表达水平较对照组显著增高(皮肤：0．039±0．013 vs．0．008±0．002，P=0．009；肝脏：0．165±0．006 vs．0．017±0．006，P=0．004；小肠：0．215±0．009 vs．0．016±0．002，P=0．003)；PAR-2基因在异基因HSCT组小鼠肝脏和小肠的表达较对照组增高(肝脏：0．010±0．002 vs．0．003±0．001，P=0．008；小肠：0．006±0．001 vs．0．003±0．001，P=0．024)，两者在其余器官的表达和对照组无统计学差异(P＞0．05)。Western blot检测PAR-1，2在蛋白水平的表达与基因表达的检测结果一致：PAR—1蛋白在异基因HSCT小鼠的皮肤、小肠、肝脏中的表达分别是对照组的6．3±1．4(P=0．022)、3．9±0．8(P=0．035)和6．2±0．6倍(P=0．018)；PAR—2蛋白在aGVHD小鼠的小肠、肝脏中的表达分别是对照组的2．85±0．3倍(P=0．037)和4．0±0．7倍(P=0．012)。免疫组织化学检查显示PAR—1在异基因HSCT小鼠皮肤上皮细胞和腺上皮细胞、肝脏汇管区以及肝细胞、血管内皮细胞，肠道的粘膜上皮和腺上皮表达明显增强；PAR—2在异基因HSCT小鼠小肠的粘膜上皮和腺上皮以及肝脏的肝细胞、血管内皮细胞表达增强，而PAR—1和PAR—2在异基因HSCT小鼠胃、肾、肺组织及对照组小鼠各组织中则无表达或表达很弱。结论：本研究显示PAR-1，2表达增高很有可能参与异基因HSCT后急性GVHD的病理过程，这有助于对急性GVHD病理机制的深入理解，并可能为急性GVHD的防治提供新的作用靶点。第二部分异基因CD8~+T淋巴细胞通过PAR-1途径诱导血管内皮细胞凋亡目的：血管内皮细胞是急性和慢性GVHD中异基因T淋巴细胞的靶组织，内皮细胞损伤也是移植相关血管疾病发生的始动环节。异基因造血干细胞移植后血管内皮损伤的机制仍不明确，本研究的目的是研究异基因CD8~+T淋巴细胞对血管内皮细胞凋亡的影响及其分子机制。方法：磁珠分选正常人外周血CD8~+T淋巴细胞。AnnexinⅤ-FITC试剂盒检测异基因CD8~+T淋巴细胞和蛋白酶激活受体—1(PAR-1)激动剂作用后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)凋亡率，RT—PCR检测PAR-1的mRNA表达，Western blot检测内皮细胞PAR-1、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Caspase-3表达。并检测PAR-1抗体、MAPK抑制剂对异基因CD8~+T淋巴细胞和PAR-1激动剂诱导的HUVEC和HDMEC凋亡的影响。结果：HUVEC与HDMEC在基因和蛋白水平均有PAR—1表达。异基因CD8~+T淋巴细胞作用24小时和48小时，HUVEC凋亡率分别为51．7±4．1％和29．4±3．3％，HDMEC凋亡率分别为28．9±2．2％和15．2±1．8％，均显著高于对照组(P＜0．01)；SFLLRN(PAR—1激动剂)诱导两种内皮细胞凋亡的作用与异基因CD8~+T淋巴细胞无统计学差异(P＞0．05)。异基因CD8~+T淋巴细胞作用后，HUVEC与HCMEC中磷酸化p38MAPK表达水平较对照组明显增强(P＜0．05)，30min时分别为对照组的9．8、6．3倍，Caspase-3裂解增加，峰值分别为对照组的5．1、4．3倍；SFLLRN作用后，HUVEC与HCMEC中磷酸化p38MAPK表达水平亦较对照组明显增强(P＜0．05)，30min时分别为对照组的9．8、6．3倍，Caspase-3裂解增加，峰值分别为对照组的5．7、2．9倍。而异基因CD8~+T淋巴细胞和SFLLRN作用后，HUVEC与HCMEC中磷酸化JNK表达水平较对照组无显著改变。PAR—1抗体可显著抑制异基因CD8~+T淋巴细胞诱导的内皮细胞凋亡，PAR—1抗体作用后异基因CD8~+T淋巴细胞诱导的HUVEC与HDMEC凋亡率分别下降了82．8％(t=7．42，P＜0．001)和76．5％(t=4．31，P=0．005)。P38MAPK抑制剂(SB203580)作用后，异基因CD8~+T淋巴细胞诱导的异基因CD8~+T细胞诱导的HUVEC和HDMEC凋亡率分别较未用药组下降76．3％(t=4．53，P=0．003)和81．6％(t=5．96，P＜0．001)。结论：异基因CD8~+T淋巴细胞通过PAR—1途径引起细胞内p38MAPK激活、Caspase-3裂解，从而诱导血管内皮细胞凋亡。这有助于深入理解异基因造血干细胞移植后急性GVHD和移植相关血管疾病的发生机制，并为防治移植并发症提供新的作用靶点。第三部分组织因子在小鼠急性GVHD模型中的表达目的：近年研究发现，血管内皮细胞异基因HSCT后供者T淋巴细胞的靶组织，血管内皮细胞损伤在急性GVHD中发挥了非常重要的作用。由于内皮细胞活化、损伤后TF表达显著增高，而TF不仅是凝血—炎症网络的重要因子，而且还通过其细胞内转导信号介导炎症过程，调节炎症细胞因子的释放。我们推测TF在急性GVHD中发挥了重要作用。本课题的目的是研究对组织因子(TF)在小鼠急性GVHD模型中的表达。方法：建立异基因HSCT后小鼠急性GVHD模型，同基因HSCT小鼠作为对照组。观察小鼠急性GVHD表现。实时定量PCR和Western blot方法检测同基因和异基因HSCT小鼠各组织中TF在基因和蛋白水平的表达。结果：异基因HSCT组小鼠在+18～+28d出现典型的急性GVHD临床和病理表现，并于移植后28d全部死亡。同基因HSCT组小鼠未见明显的急性GVHD临床和病理表现，均存活。实时定量PCR检测发现，异基因HSCT组小鼠的急性GVHD靶组织——皮肤、肝脏、胃、小肠中TFmRNA表达水平较对照组显著增强，分别为对照组的15．1±2．1，5．5±1．4，9．7±2．3，14．3±2．9倍(P＜0．01)；Western blot检测发现，在异基因HSCT组小鼠的皮肤、肝脏、胃和小肠中TF蛋白表达水平分别为对照组的13．5±2．7，6．2±0．9，7．9±1．6，15．3±3．2倍，亦较对照组明显增高(P＜0．01)。结论：TF表达增高与急性GVHD靶组织损伤相关。TF很可能参与了异基因HSCT后急性GVHD的病理过程。第四部分组织因子在急性GVHD中的作用机制研究目的：研究显示血管内皮细胞也是急性和慢性移植物抗宿主病中异基因T淋巴细胞的靶组织。异基因T淋巴细胞可诱导血管内皮细胞TF的表达。大量的研究显示，内皮细胞活化、损伤后可组织因子表达显著增高，其不仅是凝血—炎症网络的重要因子，而且还通过其细胞内转导信号介导炎症过程，调节炎症细胞因子的释放。本研究的目的是探讨组织因子TF在急性GVHD血管内皮活化、损伤中的作用及其机制。方法：磁珠阳性分选正常人外周血CD4~+和CD8~+T淋巴细胞。流式细胞术检测异基因CD4~+或CD8~+T淋巴细胞作用后脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面TF、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)阳性表达率；实时定量PCR方法检测HUVEC中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)在基因水平的表达；Western blot方法检测HUVEC中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达。实时定量PCR和流式细胞术检测抗TF抗体、p38MAPK阻滞剂或JNK阻滞剂对异基因T淋巴细胞诱导的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响。结果：①异基因CD4~+和CD8~+T细胞可显著诱导HUVEC的TF、VCAM-1、TNF-α、IFN-γ和IL-6表达。②异基因CD4~+和CD8~+T细胞作用后，HUVEC内的p38MAPK和JNK磷酸化增强，而磷酸化ERK无变化。SB203580(p38MAPK阻滞剂)作用后，异基因CD4~+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞诱导6h的HUVEC膜表面TF表达分别下降39．9±4．3％(n=6，P＜0．05)和64．4±6．1％(n=6，P＜0．01)；SP600125(JNK阻滞剂)作用后，异基因CD4~+T细胞和CD8~+T细胞诱导6h的HUVEC表面TF表达分别下降66．1±5．2％(P＜0．01)和56．8±3．4％(P＜0．01)。③抗TF抗体、p38MAPK和JNK阻滞剂均可显著下调异基因T淋巴细胞诱导HUVEC中的VCAM-1、TNF-α、IFN-γ和IL-6表达。结论：TF是血管内皮细胞参与急性GVHD免疫损伤的关键因子。异基因T淋巴细胞诱导血管内皮细胞TF表达和其他炎症因子表达可能是急性GVHD导致组织损伤的重要机制。阻断血管内皮细胞TF的表达可减少内皮细胞中引起急性GVHD的炎症细胞因子的产生，从而减轻急性GVHD，而不影响对异基因HSCT受者有利的移植物抗肿瘤作用。