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β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系。木聚糖酶具有重要的工业应用价值,在造纸、食品、饲料添加剂、生物转化、能源以及纺织等领域都显示出广阔的应用前景。木聚糖酶的热稳定性是木聚糖酶在工业应用中追求的重要特性之一。本研究通过理性设计和定向进化的方法提高G/11家族木聚糖酶的热稳定性。
来源于橄榄绿链霉菌的中温木聚糖酶SoxB和来源于褐色高温单孢菌的高温木聚糖酶TfxA虽然具有很高的氨基酸序列同源性,但两者的热稳定性却存在着显著的差异。用TfxA的N-端的31个氨基酸替换橄榄绿链霉菌木聚糖酶SoxB相应的氨基酸残基,发现木聚糖酶SoxB的热稳定性显著提高。进一步对TfxA和SoxB的N-端序列进行比对分析,发现这两种木聚糖酶N-端的差异氨基酸主要集中在四个区域。研究并首次发现,四个区域的突变并非全部参与提高中温木聚糖酶SoxB的热稳定性。其中仅R2区域(Region2)和R4区域(Region4)的突变对于提高木聚糖酶的热稳定性有贡献,尤其是R2区域的突变对于提高木聚糖酶热稳定性发挥着主导作用。对R2区域进行系统突变表明,R2区域仅五个氨基酸位点的突变(T11Y,N12H,N13D,F15Y和Y16F)将木聚糖酶SoxB的热稳定性提高了140倍。同源建模和结构分析表明,这五个突变位点通过苯环之间的相互作用以及氨基酸残基间的电荷作用稳定了木聚糖酶SoxB的N-端结构,从而共同提高了木聚糖酶SoxB的热稳定性。我们尝试将这五个位点的突变引入到其它来源的木聚糖酶(变铅青链霉菌木聚糖酶S1xB和黑曲霉木聚糖酶AnxB),结果惊奇地发现这五个氨基酸位点的突变也显著提高了这两种木聚糖酶的热稳定性。
另外,对木聚糖酶SoxB的R4区域也进行了系统突变研究,发现N32G和S33P两个位点的突变通过协同作用提高木聚糖酶SoxB的热稳定性。尝试将R2区域和R4区域热稳定性相关突变进行优化组合,共同引入SoxB,惊喜地发现木聚糖酶SoxB的热稳定性进一步大幅度提高。野生型SoxB在70℃条件下的半衰期为3.6 min,当同时引入R2和R4区域突变时,最终获得的木聚糖酶突变体在80℃的半衰期长达354 min,木聚糖酶的Tm值较SoxB提高了25.6℃。而且该木聚糖酶突变体的热稳定性甚至大大超过了高温木聚糖酶TfxA。
同时,我们也尝试运用定向进化的方法提高木聚糖酶的热稳定性。运用易错PCR法构建了木聚糖酶随机突变文库,建立了一套木聚糖酶的高通量筛选方法,并筛选得到热稳定性有所提高的突变体。以筛选获得的热稳定性相关位点信息为基础,对这些位点进行渐进重复饱和突变,获得热稳定性逐步提高的木聚糖酶突变体。