乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，也是女性癌症相关致死的主要原因之一。乳腺癌的传统治疗包括手术、放疗、化疗等。随着精准医学时代的到来，分子诊断和靶向药物治疗在乳腺癌诊疗中的作用日益凸显，即依据患者遗传信息，制定个体化诊疗方案，以期得到最佳治疗效果。其中PIK3CA、ESR1、及ATK1等基因的单个核苷酸变异(Single Nucleotide Variation，SNV)，CCND1、ERBB2等基因的拷贝数变异（Copy Number Variations，CNV）为乳腺癌相关靶基因变异的最常见类型和药物靶点。　　循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)与组织活检样本相比，取材更方便、均质性好，可重复取样，能动态反映肿瘤DNA改变，被称为“新一代癌症标志物”。因肿瘤基因位点日益增多，传统方法已不能满足需要。新一代测序(Next-generation sequencing，NGS)技术的发展，使得以多基因盘形式进行检测成为可能。　　尽管国家食品药品监督管理总局(CFDA)已批准部分检测试剂，但因靶向基因众多，许多项目仍需实验室自建方法和自配试剂(Laboratory Developed Tests，LDTs)，当前也无CFDA批准用于NGS检测乳腺癌ctDNA的商品试剂盒。为保证检验质量，临床实验室在正式开展日常检测之前，应对LDTs进行性能确认，证明其能满足相应临床预期用途，因此需要参考物质（reference material，RM）。但当前国内外尚无专门用于NGS检测乳腺癌ctDNA方法性能确认的RM，无法对自建方法进行全面性能评估，也不能满足实验室检测质量保证包括室内质量控制（Internal Quality Control，IQC）和室间质量评价(External Quality Assessment，EQA)的需求。　　本研究以细胞系基因组DNA(genomics DNA，gDNA)为模板，通过PCR和定点诱变PCR技术制备模拟突变片段，与gDNA按不同比例混合后超声打断，制备参考物质即模拟cfDNA，并联合应用乳腺癌细胞游离DNA(cell free DNA，cfDNA)对乳腺癌ctDNA高通量测序检测方法进行分析性能确认，包括建立测序质量性能指标和可报告范围，评价其检测下限、精密度、准确度、多重测序交叉频率及与数字PCR检测方法的符合性等。本研究主要对SNV和CNV两种最常见类型的检测性能进行确认。　　结果表明，模拟cfDNA片段长度分布、reads质量和靶向捕获效率等指标与血浆cfDNA相近;对于SNV，当突变等位频率（Mutant allele frequency，MAF）≥0.5％时，灵敏度为96.30％，并具有高特异度(99.9997％)和准确度(99.9996％);当CNV达1.25×，特异度为99.77％，准确度为99.76％时，灵敏度为95.83％。当SNV达到0.5％，CNV达1.25×时，批内和批间精密度均能达95％以上。同时NGS与数字PCR结果高度一致，多重测序交叉污染率低（0％～0.24％，但阳性reads在数据分析中均能被过滤去除）。　　综上所述，本研究制备了乳腺癌ctDNA高通量测序检测参考物质，并联合应用血浆cfDNA对乳腺癌ctDNA高通量测序检测方法进行性能确认，明确其可报告范围、检测下限、精密度、准确度以及多重测序交叉频率等性能指标。结果表明，制备的参考物质可用于NGS检测乳腺癌ctDNA性能确认，所评价的方法具有良好的检测性能。　　本研究的创新性主要有:(1)通过PCR和定点诱变PCR的方式制备乳腺癌相关基因的模拟cfDNA作为乳腺癌ctDNA高通量测序检测的参考物质，制备方式简单、快速且可稳定获取，可用于乳腺癌相关基因NGS检测的分析性能确认，也可用于乳腺癌相关基因NGS检测的室内质量控制和室间质量评价;此外，该制备方式也可用于制备其他肿瘤相关基因的ctDNA参考物质;(2)对通过Illumina Hiseq3000平台检测乳腺癌ctDNA的方法进行了系统的分析性能确认，为应用该平台及所评价的检测方法检测乳腺癌ctDNA提供了理论和实践依据。性能确认思路可为临床实验室建立其他肿瘤的ctDNA检测NGS方法性能确认提供借鉴。