本草基因组计划(Herb Genome Program,HGP)是针对有重要经济价值、资源濒危等药用植物开展的功能基因组学、蛋白组学、代谢组学及遗传代谢工程和分子遗传育种研究,旨在选育高品质、高产量、抗胁迫的药用植物,并建立现代中药有效成分生物工程体系,其中转录组是HGP最活跃的研究领域之一。在岭南地区有不少药用植物,如青天葵,都面临着资源濒危,已有的资源获得方法无法满足需求,而且功能基因等研究仍属空白的现状。青天葵来源于兰科植物毛唇芋兰Nervilia fordii(Hance)Schltr.的叶片或全株。具有润肺止咳、清热解毒、散瘀止痛的功效,对小儿呼吸道疾病、小儿疳积疗效显著。青天葵不仅为岭南道地贵重药材,也是出口创汇中药,市场需求量大。由于人类过度开采和自身萌发条件苛刻,青天葵的野生资源已渐枯竭,其也己先后被列入《中国南部石灰岩稀有濒危植物名录》和《濒危动植物物种国际贸易公约》。组织培养和人工栽培是目前尝试获得青天葵资源的主要方法,但人工栽培和组织培养分别面临着种苗稀缺和“炼苗下田”、扩大种植等瓶颈问题,因此,通过这两种方法获得的青天葵远远不能满足市场和临床需求。在供需严重失衡的情况下,市场上出现了青天葵的众多混伪品、混淆种。此外,青天葵商品药材还根据叶片大小分为大、中、小叶3个等级。本论文通过分析青天葵及其混伪品、同属植物的DNA条形码序列的差异信息,建立起青天葵的新型真伪鉴别体系。以种质明确的青天葵为材料,在RNA水平上进行青天葵转录组高通量测序,建立起青天葵的转录组特征及其数据平台,利用生物信息学挖掘青天葵次生代谢产物合成、生理功能等相关基因,并且通过对器官大小相关基因EBP1进行克隆和表达,验证青天葵转录组特征的可行性,为利用生物技术进行化学成分调控和品种选育提供基础数据。方法和结果概括如下：1基于DNA条形码的青天葵真伪鉴别利用MEGA软件分析3种叶型青天葵及其混伪品毛叶芋兰、车前草、红薯叶、积雪草的ITS2、rbcL、matK条形码序列信息,获得的ITS2序列的变异程度最高(89.3%),变异位点总数最多的则是matK基因(242个)。青天葵的种内遗传距离在0.000～0.004之间,不同序列的平均种间遗传距离变化范围为0.088-1.138,其中ITS2平均遗传距离最大,rbcL平均遗传距离最小。青天葵及其混伪品种间遗传距离远远大于青天葵的种内遗传距离,表明3条DNA条形码序列都有足够的差异来鉴别青天葵及其混伪品,基于3条序列构建的NJ聚类树也均能直观地区别青天葵及其混伪品。然而,3种叶型青天葵的7个样品rbcL和matK序列则完全一致,中、小叶型青天葵的核ITS2序列未获得合格序列,因此未能在以上3条形码序列中找到青天葵分型依据。应用相应的通用引物分别进行PCR扩增并测序,进一步评估ITS2、rbcL、matK, LSU D1-D3等DNA片段对青天葵与芋兰属近缘物种的鉴别效果。各候选序列PCR扩增效率均达到100%。测序成功率以rbcL和LSU D1-D3最高,matK和ITS2稍低。在种内变异方面,matK, LSU D1-D3在各物种的居群内和不同居群间均没有变异,而ITS2和rbcL序列均存在微小的变异；ITS2种间变异则远远大于其他3个候选片段。matK序列种间和种内遗传变异没有重叠,存在明显的barcoding gap,能将供试的7个物种完全鉴别：ITS2种内和种间变异有部分重叠,但种间变异程度高,有利于区分青天葵及其同属植物。基于matK序列构建的系统发育树展示了7种芋兰属物种的亲缘关系。综合PCR扩增和测序成功率,barcoding gap和鉴定效率评价,matK序列较其他条形码具有明显的优势,可作为青天葵真伪鉴别的DNA标志以及芋兰属潜在DNA条形码。2青天葵转录组特征研究通过Illumina Hiseq2000高通量测序从青天葵叶片和球茎中分别获得47,668，726和54,589,832个读序,总核苷酸数达9.20Gb,最终从青天葵叶片和球茎共组装出142,220条Unigene。从筛选所获得的5,223条Unigene序列中共鉴定出5,684个SSR模体,类型为二至六核苷酸模体,其中二核苷酸AG/CT出现频率最高。青天葵转录组共有38,640条Unigene (27.17%)被注释到COG数据库的25个功能类别；110,029条Unigene (77.37%)被归类到GO数据库生物学过程、在细胞中所处的位置、分子功能三大类别；28,970条Unigene可归入KEGG数据库的黄酮类生物合成等281个代谢途径。青天葵叶片和球茎转录组表达差异显著Unigene(错误发现率不大于0.001、Unigene在球茎表达量与在叶片表达量的比值的对数值不小于1),共为62,205条,包括了表达上调Unigene31,488条和表达下调Unigene31,117条。注释获得参与青天葵黄酮类生物合成途径10个关键酶、萜类生物合成途径的18个关键酶以及生理功能过程的27个功能基因,并明确了它们在叶片和球茎中的表达水平以及组织差异性。3青天葵转录组的验证—器官生长调控基因NflFBP1的克隆与分析根据从青天葵转录组Unigene数据库比对和注释,获得NfEBPl长度为1185bp的Unigene片段。应用RACE技术扩增cDNA序列全长,通过设计引物扩增并获得1188bp的NfEBP1编码区序列,该序列与转录组Unigene片段相似度达到99%。编码蛋白NfEBP1含有395个氨基酸,分子量为43.5KDa,不含信号肽、线粒体或叶绿体靶向转运肽,整个多肽链位于膜外。NfEBP1与来源于沙冬青和土豆的EBP1蛋白同源性分别为82%和86%,均具有PA2G4细胞增殖功能域,归属于APP MetAP超级家族。以青天葵不同组织(叶片、叶柄和球茎)总RNA反转录产物为模板进行qPCR扩增,通过GeNorm和NormFinder软件评价5个常用内参基因18s rRNA.Actin、 Ubiquitin、EF-1α、β-tubulin的表达稳定性,确定β-tubulin作为内参基因用于校正qPCR分析NfEBP1基因在青天葵不同部位的相对表达量的差异。采用公式计算相对表达量F=2-ΔΔCt,NfEBP1基因在青天葵不同组织的表达量存在差异,其中在叶片的表达水平最高,其次为球茎,叶柄则最低。NfEBP1在青天葵不同组织中的表达趋势与其转录组特征一致,说明了青天葵转录组应用于后续研究中的可行性。克隆获得的器官生长调控基因NfEBP1可为后续研究中利用植物基因工程技术促进青天葵叶片等器官生长、提高青天葵产量提供基础数据。综上所述,本研究以通过DNA条形码鉴定的青天葵为材料,在RNA水平上建立起青天葵转录特征并验证其可行性,挖掘到参与青天葵次生代谢产物生物合成、生理过程的关键基因,为青天葵的基因调控研究和优育品种选育、产量提高奠定了坚实的基础,也为其他濒危南药的资源保护提供一种新的思路。