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研究目的:研究目的:运动性心律失常一直是体育科学和医学领域十分关注的医学问题,部分运动性心律失常的发生与长期反复大强度运动对心脏的病理性损伤有关,往往影响到运动员的身体健康、系统训练以及比赛成绩。近年研究发现,反复大强度运动造成的心肌损伤纤维化可能与运动性心律失常的发生有关,而损伤纤维化的与高强度运动持续时间关系如何?心肌不同部位纤维化程度是否存在差异?尚不明确。TGF-β1/Smad信号通路是介导纤维化损伤的关键途径,其是否参与了运动性心肌纤维化的调节,目前尚未发现报道。因此,本研究通过建立长期反复大强度运动诱导的心肌损伤纤维化动物模型,探讨TGF-β1/Smad信号通路及其下游因子在运动性损伤心肌纤维化过程中的调控作用。第一部分:长期运动对大鼠心肌损伤和胶原蛋白的影响研究方法:72只SD大鼠分为3组,安静组(C)、中强度组(M)和大强度组(H)。每组又分为8周组、12周组和16周组,每组8只,分别运动8周、12周、和16周。M组跑台速度为15m/min,坡度为5°(相当于58.4±1.7%VO2max负荷强度),H组跑台速度为28m/min,坡度为10°(相当于81.0%±3.5%VO2max负荷强度),每天运动1小时,每周运动5天。小动物超声心动仪检测大鼠心肌结构和功能变化,Elisa法检测大鼠心肌c Tn I的变化,透射电镜和HE染色观察大鼠心肌超微结构和组织形态学改变。样本碱性水解法间接检测大鼠心肌胶原蛋白含量的变化,天狼星红染色观察大鼠胶原蛋白在心肌不同部位的分布,并计算CVF(cardial volume fraction,CVF)的变化。免疫荧光组织化学法和RT-PCR检测心肌I型胶原和III胶原的分布和含量变化。观察随运动时间和运动强度的变化,心肌不同部位心肌损伤程度和胶原蛋白含量的变化。免疫荧光组织化学法检测α-SMA的分布和表达。研究结果:(1)随着运动时间的增加,M组和H组大鼠体重均显著性降低。M组和H组大鼠心脏重量指数逐渐增加。(2)8周运动后,M组和H组左心室结构指标变化不明显。M组LVEF显著增加,而H组无明显改变。M组和H组右心室RVDs和RVDd显著增加,RVFS和RVEF无明显改变。16周运动后,M组和H组LVDd和LVDs均出现显著增加,H组增加的幅度更大。H组左心室LVEF和LVFS均有显著性降低。M组和H组RVDs和RVDd均有不同程度增加,H组RVEF显著性降低,而M组无明显改变。(3)8周、12周和16周运动后,H组c Tn I的含量均显著增加,而M组无明显改变。(4)透射电镜显示,运动各周期M组和H组均发现线粒体增多聚集。H组肌纤维断裂缺失,闰盘不连续,而M组无明显肌纤维损伤。运动各周期,HE染色显示H组心肌有不同程度的损伤,右心室心肌的损伤程度大于左心室,而M组未见明显的心肌损伤。(5)随运动时间的延长,H组心肌羟脯氨酸和CVF逐渐增加,12周和16周心房和右心室出现显著性改变,而左心室无明显变化。M组羟脯氨酸和CVF也具有增加趋势,但无明显差异。(6)随运动时间的延长,H组I型胶原蛋白增加的幅度逐渐增大。16周H组心肌I型胶原的表达均有显著性的增加,心房和右心室增加的幅度要大于左心室。(7)随运动时间的延长,M组和H组III型胶原蛋白的表达逐渐增加,12周和16周心房、右心室和左心室III型胶原均具有显著性增加,H组的增加幅度大于M组。(8)16周运动后,H组右心房和右心室Col-I和Col-III蛋白的比值显著升高,而左心室变化不明显。M组的比值也有所增加,但无显著性差异。(9)运动各周期,M组和H组均未发现大鼠心肌α-SMA蛋白的表达。研究结论:长期中等强度运动使左、右心腔增大,增强了心脏的射血功能,可能与中强度运动促进胶原蛋白的适度增加有关。长期大强度导致大鼠心脏射血功能降低,心肌发生损伤,心肌胶原蛋白过的增加,主要发生在心房和右心室。长期大强度运动造成I/III胶原蛋白比例失调,心房和右心室发生纤维化,可能是导致心脏功能异常和运动性心律失常的重要病理机制。心肌未检测出肌成纤维细胞,提示长期大强度运动导致的胶原蛋白的增加可能是纤维化的早期阶段。第二部分:TGF-β1/Smad信号途径在运动性心肌纤维化中的调节作用研究方法:RT-PCR和Western Blot法检测纤维化关键因子(TGF-β1)、通路调节因子(Smad-2、Smad-3、Smad-4、Smad-7)、下游胶原降解调节因子(MMP-1、TIMP-1、MMP-2和TIMP-2)和胶原合成调节因子(CTGF和micro RNA-21)在C组和H组大鼠心肌中的表达,探讨其在运动性心肌纤维化发生过程中调节作用。研究结果:(1)8周运动后,H组心房、右心室和左心室TGF-β1的表达均显著增加。12周和16周H组心房和右心室TGF-β1的表达均显著增加,而左心室变化不明显。随着运动时间的延长,H组TGF-β1的表达有逐渐降低的趋势。(2)大强度运动对心肌Smad-2和Smad-3无明显影响。(3)随着运动时间的延长,Smad-4的表达逐渐增加,而Smad-7的表达逐渐降低。16周运动后,心肌Smad-4的表达显著增加,而Smad-7的表达显著降低,心房和右心室的变化幅度均大于左心室。(4)心肌MMP-1的表达变化不明显。12周和16周后,心房和右心室TIMP-1的表达显著性增加。随着运动时间的延长,H组MMP-1的表达具有逐渐降低趋势,TIMP-1的表达逐渐升高。心房和右心室MMP-1/TIMP-1的比例显著降低,而左心室无明显变化。(5)随运动时间的延长,H组心肌MMP-2的表达逐渐增加。16周后,MMP-2显著增加,TIMP-2无明显变化,心肌MMP-2/TIMP-2的比值显著增加,心房和右心室MMP-2、MMP-2/TIMP-2的增加幅度大于左心室。(6)随运动时间延长,CTGF具有逐渐增加趋势,但8周和12周均无显著变化。16周后,H组心房CTGF的表达显著性增加,而左、右心室CTGF均无明显变化。(7)运动8周、12周和16周,H组心肌mi R-21的表达显著性增加,心房和右心室增加的幅度大于左心室。研究结论:长期大强度运动引起TGF-β1的持续高表达,通过信号通路蛋白Smad-4和Smad-7介导,进而造成MMP-1/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2的比例失调、CTGF的表达增加、mi R-21持续表达上调,使胶原蛋白的降解发生异常,同时增加了胶原蛋白的合成,导致胶原蛋白的过度堆积诱发了心肌纤维化,可能是心脏功能发生异常和心律失常的分子机制。心房和右心室TGF-β1/Smad通路及下游调控因子的变化幅度大于左心室,可能是心房和右心室的损伤程度较大和发生纤维化的分子机制。