论文部分内容阅读
前言 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)可引起人支气管炎和原发性非典型肺炎。黏附于宿主呼吸道上皮细胞是Mp致病的关键步骤。而P1黏附蛋白是Mp的主要黏附蛋白，也是Mp的主要免疫原，在其羧基端含有高免疫区。P1黏附蛋白或其亚单位可作为Mp基因工程疫苗和诊断试剂盒的候选蛋白。本实验以Mp FH株为模板，PCR扩增获得3′端p1基因片段(p1′基因)后，克隆到载体pGEX-6p-1后测序，并转入大肠杆菌BL21中表达。表达的重组蛋白经纯化后，通过免疫印迹实验检测重组蛋白的生物学功能，以初步探讨其做为诊断试剂和疫苗的候选抗原的可行性。 方法 1．扩增模板的制备：Mp FH菌株培养及染色体DNA提取按本实验室常规方法进行。 2．目的基因片段的扩增：根据GenBank提供的Mp FH株p1基因序列设计PCR引物，由上海生物工程公司合成。上游引物序列：5′-GTGAATTCGCGAGTGCTTACAAGC-3′(EcoRⅠ)，下游引物序列：5′-AGCTCGAGAA ACGGACTAAACAAG-3′(XhoⅠ)。反应程序如下：94℃预变性5min后，开始循环，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，共20个循环，最后72℃延伸5min。 3．表达载体构建：对载体pGEX-6p-1和扩增的p1′基因用EcoRⅠ酶、XhoⅠ酶进行双酶切，连接，构建重组质粒pGEX-6p-1-p1′。在大肠杆菌BL21中扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增鉴定。 4．核苷酸序列测定：委托大连宝生物工程有限公司测定pGEX-6p-1-p1′重组质粒中插入片段的核苷酸序列，并与GenBank中的p1基因序列进行同源性比较。 5．重组蛋白表达和鉴定：将阳性克隆株培养菌液接种于含氨苄青霉素(Amp，100μg／ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。再按1％转接至于含氨节青霉素(AmP，roo林岁初，)的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养3h，加人IPTG至终浓度为0.1~OFL，诱导表达sh，4℃离心收集菌体。冰浴下超声破碎，离心后取上清通过Bulk GST Pur访cation Modde试剂盒纯化GsT一Pl’融合蛋白。SDS一PAGE分析表达产物的相对分子量。按Sam-brook实验手册方法进行Westeobl()t实验，自制兔抗MP全菌抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I醛为二抗。结果 1.PCR扩增结果:PCR扩增出的pl‘基因长度为894bp。经1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，空白对照组可见由引物二聚体所形成的微弱条带，实验组在10O0bp和75Obp之间可见PCR扩增产物所形成的清晰条带，扩增产物大小与预期长度基本相符。 2.重组质粒鉴定:以重组质粒为模板，PCR扩增可出现单一条带，片段大小与预期长度一致。重组质粒用Ec0RI酶、xhol酶双酶切可产生4 .gkb和0.gkb两个基因片段。用EcoRI单酶切产生一条5.skb基因片段。表明目的基因存在于重组质粒中，且为正‘向插人，与所设计的定向克隆相一致。 3.核昔酸序列分析:测序结果与GenBank中的pl基因核昔酸序列(A兄90001、A几90002、A兄86371、AE0(刃002、MZ1519、M18639)比较，其同源性为99.66%一100%。氨基酸序列同源性为99.32%一100%。测序结果进一步表明，插人的Pl‘基因序列完全正确，插人位点和位相与设计相符，保证了GST与Pl‘蛋白的一致读框。 4.Westem blot检测融合蛋白:纯化的重组蛋白进行，SDS一以GE分析结果显示，重组株经诱导表达相对分子质量(Mr)为59kDa的蛋白质，与预期值相符。Westem blot结果显示兔多价抗血清与过柱纯化的重组蛋白在59kDa处形成了特异的抗原一抗体反应条带，说明该重组蛋白可被兔抗MP多价抗血清识别，证实该重组蛋白含有Pl戮附蛋白的特异性抗原决定簇。结论 1、本实验克隆了3’端pl基因片段，构建了pGEx石p一1一pl‘重组质粒，在大肠杆菌内获得稳定表达的重组‘蛋白。通过Westem blot证实表达的59kDa重组蛋白具有免疫反应性，可作为诊断试剂的候选蛋白。 2、本实验所克隆的pl‘基因还包含了与细胞戮附相关的DZ区域，可进一步验证本实验所表达的融合蛋白是否具有免疫原性，为Mp的疫苗研制做铺垫。