生物催化α-羟基腈生产α-羟基羧酸的微生物筛选及其水解反应的研究

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本文以羟基乙腈转化为羟基乙酸为模式反应,选育能够生物催化羟基腈生产相应羧酸的微生物菌株,以满足腈化合物生物转化和生物催化技术发展的需要,为工业生物催化提供有效的生物催化剂和工艺路线。论文以羟基乙腈为惟一氮源进行富集,基于羟基乙酸与β-萘酚的显色反应,建立了高通量菌株筛选模型。此比色法不仅适合大规模的菌种初筛,也可应用于羟基乙酸的定量分析。利用建立的筛选模型,得到了4株具有羟基乙腈水解活力的菌株,其中N595活力最高,经鉴定确定其为红球菌(Rhodococcus)。底物特异性研究表明Rhodococcus sp.N595催化腈化合物水解主要是通过腈水合酶/酰胺酶双酶耦联途径进行的。产酶培养基和培养条件的优化显著提高了Rhodococcus sp.N595的酶活,其最佳组合为甘露醇8g/l,蛋白胨4.9g/l,酵母膏4.1g/l,K2HPO4 1g/l,KH2PO4 1g/l,MgSO4 0.2g/l,FeSO4 0.03g/l,NaCl 1g/l,己内酰胺0.5g/l,pH 8.0。静息细胞催化反应条件及酶促反应动力学研究表明,Rhocococcus sp.N595水解羟基乙腈的最适反应温度为42℃,胞内酶热稳定性较好,42℃时半衰期为45.2 h;最适反应体系为pH 7.5-7.8 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液;Mg2+、Fe2+等对细胞活性具有明显的促进作用;高浓度的底物和产物对酶促反应具有抑制效应,在最适底物浓度1.6g/l时,Rhocococcus sp.N595菌悬液可连续进行3个批次的反应,转化液中羟基乙酸的累积浓度达到4.7g/l;当反应体系中羟基乙酸的浓度达到2g/l左右时就会抑制反应速度;最后对酶促反应动力学进行了探讨,最大反应速率Vmax=2.816 mmol l-1min-1,表观米氏常数Km=12.157 mmol/l,底物抑制常数Ks=53.78mmol/l。
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