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研究目的:宫颈癌（cervical cancer,CC）是全球第四常见的女性恶性肿瘤,HPV感染是其主要的致病因素。虽然有疫苗以及宫颈癌筛查的普及,但在发展中国家,宫颈癌的发病率仍居高不下。在中国,宫颈癌是女性第二常见的恶性肿瘤,近20年来,宫颈癌患者的年龄趋于年轻化,十年内发病的平均年龄下降了5岁;且大多数患者被诊断时已经为III-IV期宫颈癌,失去手术治疗的机会,或者为局部晚期,即肿瘤大小>4cm,FIGO分期（2009）IB2和IIA2（Locally Advanced Cervical Cancer,LACC）。然而LACC的患者因为肿瘤直径及范围较大,高危因素多,局部病灶难以控制,治疗难度高,复发率和死亡率都很高,预后不良,总的5年生存率仅为60%,因此,除常规手术、放化疗治疗外,有必要寻找新的治疗方法或选择更好的治疗策略来治疗宫颈癌,尤其是LACC。circRNAs的研究的兴起得益于高通量测序的发展,在真核细胞中发现了数千种circRNAs,众多报道证实circRNAs在恶性肿瘤起到了十分重要的作用,但在妇科恶性肿瘤,特别是宫颈癌中的作用研究的不够深入。本研究通过课题组前期工作基础,利用circRNA microarray技术筛选H8（宫颈永生化上皮）细胞系及Si Ha细胞系中差异表达的circRNAs,探索circNFATC3在宫颈癌中的表达及潜在作用机制。研究方法:1.根据课题组前期工作基础,挑选circNFATC3进一步研究,Sanger Sequencing验证环状结构,用q RT-PCR检测circNFATC3在40个宫颈癌患者癌组织与癌旁组织中的表达,分析circNFATC3与宫颈癌患者临床病理参数的关系。2.通过检测circNFATC3在四种宫颈癌细胞系中表达,选择HeLa及Si Ha构建circNFATC3过表达及敲减的稳转细胞株,并用q RT-PCR验证稳转的成功。我们用一系列细胞功能实验检测circNFATC3不同表达量对宫颈癌细胞生物学行为的影响。我们用CCK-8及Ed U检测宫颈癌细胞的增殖能力,用划痕实验检测宫颈癌细胞的迁移能力,用transwell Matrigel实验检测宫颈癌细胞的侵袭能力。3.通过Arraystar’s home-made miRNA targe预测可能与circNFATC3结合的miRNAs,通过q RT-PCR检测不同表达量对这些miRNAs表达的影响,发现miR-9-5p与circNFATC3的表达呈显著负相关,考虑miR-9-5p与circNFATC3结合的可能性大。通过RIP看两者是否在RISC复合体中,进一步利用双荧光素酶实验证实了两者的相互结合。我们又检测miR-9-5p在宫颈癌癌组织及癌旁的表达,探索miR-9-5p的表达与circNFATC3表达的相关性。4.再次利用CCK-8、Ed U实验、划痕实验以及transwell Matrigel实验验证miR-9-5p对HeLa及Si Ha细胞系增殖、迁移、侵袭的影响。进一步,我们利用bioinformatics analysis software—Target Scan分析可能与miR-9-5p结合的靶基因,并用q RT-PCR进行检测和筛选,发现SDC2有可能与miR-9-5p结合,并再次利用双荧光素酶验证两者相互关系。我们进一步利用WB证实了miR-9-5p可以影响SDC2以及下游蛋白的表达。5.我们再次利用细胞功能实验,检测miR-9-5p的表达是否可以改变circNFATC3对宫颈癌生物学行为的影响,并且利用WB从蛋白水平验证。6.我们利用体内实验,在裸鼠皮下注射circNFATC3过表达的HeLa细胞,并与对照组对比,观察皮下成瘤的情况,从体内水平验证circNFATC3对宫颈癌细胞的影响。研究结果:1.circNFATC3在宫颈癌组织中的表达明显升高,具有统计学意义;并且升高与肿瘤大小和间质浸润显著相关,但与患者年龄、FIGO分期、组织学类型和分级,淋巴结转移都无关。2.在circNFATC3过表达的HeLa细胞中,circNFATC3的过表达可以增加HeLa细胞增殖、迁移以及侵袭能力;而circNFATC3敲低则抑制了Si Ha细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。3.Arraystar’s home-made miRNA targe预测了circNFATC3的五个候选miRNA:hsa-miR-744-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-377-5p、hsa-miR-661和hsa-miR-9-5p。通过q RT-PCR证实了miR-9-5p的表达与circNFATC3的表达呈负相关。并用RIP实验证实了两者确实均存在于RISC复合体中,两者可能相互结合,并进一步通过双过双荧光素酶实验证实了两者的结合关系。q RT-PCR检测了miR-9-5p在组织中的表达,miR-9-5p在癌组织里低表达,与circNFATC3的表达呈负相关。4.细胞功能实验验证了miR-9-5p抑制了HeLa、Si Ha细胞增殖、迁移及侵袭能力。Target Scan预测了并筛查了miR-9-5p潜在靶基因SDC2,并用双荧光素酶证实了两者的结合。WB实验证实了miR-9-5p mimics可以减少SDC2以及下游蛋白的表达,miR-9-5p inhibitors可能增加SDC2及靶蛋白的表达。5、在我们证实了circNFATC3可与miR-9-5p相关结合之后,我们利用细胞功能实验进一步证明了miR-9-5p可以改变circNFATC3的促癌作用,并通过WB从蛋白水平验证了circNFATC3及miR-9-5p不同表达对下游SDC2的表达的影响。6、在裸鼠的体内实验中,证实circNFATC3可以促进宫颈癌细胞的生长,并通过免疫组化证实了circNFATC3的过表达增加SDC2的表达。研究结论:1.在宫颈癌组织中,circNFATC3表达高于癌旁组织,表达与肿瘤大小及间质浸润相关。2.circNFATC3可以促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并且可与miR-9-5p靶向结合。3.在宫颈癌组织中,miR-9-5p呈低表达,抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭,可与下游SDC2靶向结合。4.circNFATC3通过靶向结合miR-9-5p上调SD2,促进宫颈癌的进展。