目的:脓毒症因伴有多脏器功能障碍而具有很高的病死率,其中心功能障碍的发生更为常见。伴有心功能障碍的脓毒症患者具有不良的预后。当脓毒症发生代谢异常和循环障碍时,即可发展为脓毒性休克。脓毒性休克心功能障碍的发病率更高,与病死率增加独立相关。为了挽救患者的生命,迫切需要探寻新的诊断和治疗靶点,降低重症病人的病死率。然而,脓毒性休克心功能障碍的发病机制复杂,与细胞因子抑制作用、细胞凋亡、能量代谢等多方面因素相关,目前认为脓毒性休克心功能障碍的发生发展是多种因素共同作用的结果。环状RNA（circRNA）是一类新的内源性非编码RNA,当前体mRNA成熟时,由外显子或内含子反向剪接而成的闭合连续环状结构。CircRNA分布广泛,在不同的组织和细胞中具有不同的表达,因其环状结构而具有高度的稳定性。CircRNA在多种生命过程中具有潜在基因调控的作用。许多circRNA在心血管疾病中异常表达,参与细胞的炎症反应、细胞凋亡等多种生物学功能的调节。为了探究circRNA是否在脓毒性休克心功能障碍中发挥作用,我们以脓毒性休克大鼠和正常对照组大鼠心肌组织转录组测序结果为基础,通过生物信息学分析,筛选差异表达的circRNA,并进一步研究差异表达的circ＿0008082在脓毒性休克大鼠心功能障碍中发挥的作用及其调控机制。方法:我们以本课题组前期脓毒性休克大鼠（6只）和对照组大鼠（6只）心肌组织全转录组测序结果为基础,采用生物信息学计算方法,筛选表达水平具有显著差异的circRNA、miRNA和mRNA,构建脓毒性休克心功能障碍相关circRNA介导的ceRNA调控网络。采用大鼠腹腔注射LPS（20mg/kg）的方法构建脓毒性休克心功能障碍模型。LPS注射后的12小时留取大鼠左室心肌组织及血浆。通过H&E染色明确大鼠心肌组织损伤情况。ELISA方法测定大鼠血浆促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和心肌细胞损伤标志物（CKMB、c Tn I）表达水平。使用qRT-PCR方法检测心肌组织促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和凋亡相关基因（bax,bcl2,caspase3）的mRNA表达水平。TUNEL方法检测心肌组织凋亡情况。Western Blot方法检测心肌组织凋亡相关蛋白（bax,bcl2,caspase3）的表达水平。上述实验证明模型建立成功后,应用qRT-PCR方法在大鼠心肌组织验证环状RNA测序结果的准确性。使用LPS（10μg/m L）诱导H9c2大鼠心肌细胞构建脓毒性休克心功能障碍体外模型。将部分差异表达的circRNAs在细胞水平进行验证,筛选出circ＿0008082。使用sanger测序、R Nase R消化、聚合引物和发散引物扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的实验方法,证明circ＿0008082是环状RNA。设计circ＿0008082特异性探针,应用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）明确circ＿0008082的细胞定位。根据生物信息学构建的ceRNA调控网络,使用双荧光素酶报告基因分析实验验证与circ＿0008082能够结合的miRNA及与miRNA能够结合的mRNA,进一步通过对基因的敲减和过表达,获得circ＿0008082介导的circRNA-miRNA-mRNA调控轴,并在细胞水平进行功能研究。通过ELISA实验方法评估心肌细胞的炎症损伤情况。使用流式细胞术分析心肌细胞的凋亡水平。应用免疫印迹法分析凋亡相关蛋白（bax、bcl2和caspase3）的表达水平。结果:1.通过对转录组测序结果的分析,筛选出脓毒性休克大鼠心肌组织差异表达的circRNA共有19个,其中上调的circRNA有12个,下调的circRNA有7个。差异表达的miRNA共有63个,其中上调的miRNA有50个,下调的miRNA有13个。差异表达的mRNA共有1591个,其中上调的mRNA有937个,下调的mRNA有654个。通过构建ceRNA调控网络,我们筛选出与脓毒性休克大鼠心功能障碍密切相关的circRNA-miRNA-mRNA调控网络,其中包含11个circRNA,21个miRNA,41个mRNA。2.我们使用LPS成功构建了大鼠脓毒性休克模型,在腹腔注射LPS后的2小时左右,大鼠的血压开始下降,并且下降水平可稳定持续至12小时。H&E染色可见脓毒性休克大鼠心肌组织与对照组相比,心肌细胞排列紊乱,胞浆淡染,心肌细胞水肿、溶解、坏死,大量炎症细胞浸润。脓毒性休克大鼠心肌组织和血清炎性生物标志物（TNF-α、IL-1β、IL-6）明显升高,血清心肌损伤标志物（c Tn I、CK-MB）明显升高。脓毒性休克大鼠心肌组织TUNEL染色显示凋亡率明显增加,心肌组织促凋亡基因bax和caspase3的mRNA和蛋白表达水平显著增高,抑制凋亡基因bcl2的mRNA和蛋白水平显著降低。大鼠心肌组织验证差异表达的circRNA,与测序结果具有良好的一致性。3.将心肌组织验证的差异表达的circRNA,在H9c2大鼠心肌细胞中进行验证,结果显示circ＿0008082在LPS诱导的H9c2心肌细胞中表达水平显著升高,与在脓毒性休克大鼠心肌组织中的表达趋势一致。通过Sanger测序证实了circ＿0008082的成环剪接位点,结果与预测环化位点的序列完全一致。我们分别以cDNA和基因组DNA（g DNA）为模板,使用聚合引物和发散引物进行扩增,结果显示cDNA中聚合引物和发散引物均存在产物,而g DNA中仅在聚合引物中存在扩增产物。在RNase R处理下,circ＿0008082由于其共价闭环结构而不能被RNase R降解。FISH结果显示circ＿0008082主要定位在细胞质。通过敲减和过表达circ＿0008082,显示circ＿0008082促进LPS诱导的H9c2心肌细胞的炎症损伤和凋亡。4.双荧光素酶报告基因分析实验证明circ＿0008082与miR-145-5p、miR-145-5p与YTHDF2能够靶向结合。circ＿0008082与miR-145-5p、miR-145-5p与YTHDF2具有负向调控关系,circ＿0008082与YTHDF2具有正向调控关系。miR-145-5p在脓毒性休克大鼠心肌组织和LPS诱导的H9c2心肌细胞中表达水平显著降低,而YTHDF2的表达呈现高水平。功能实验证明miR-145-5p和YTHDF2均参与了LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症损伤和凋亡。结论:1.脓毒性休克大鼠心肌组织中存在差异表达的circRNA、miRNA和mRNA,成功构建了ceRNA调控网络,预示这些表达水平具有显著差异的非编码RNA能够在脓毒性休克大鼠心功能障碍中发挥重要作用。通过脓毒性休克大鼠心肌组织环状RNA的验证,说明测序结果具有良好的准确性。2.Circ＿0008082在脓毒性休克大鼠心肌组织和LPS诱导的H9c2心肌细胞中表达水平显著增高,是真实存在的环状RNA,主要分布在细胞质。在LPS诱导的H9c2心肌细胞中能够促进细胞的炎症损伤和凋亡。3.miR-145-5p在脓毒性休克大鼠心肌组织和LPS诱导的H9c2心肌细胞中表达水平显著降低,在LPS诱导的H9c2心肌细胞中抑制细胞的炎症损伤和凋亡。4.YTHDF2在脓毒性休克大鼠心肌组织和LPS诱导的H9c2心肌细胞中表达水平显著增高,敲减YTHDF2能够有效抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞的炎症损伤和凋亡。5.Circ＿0008082通过竞争性结合miR-145-5p靶向调节YTHDF2促进LPS诱导的H9c2心肌细胞的炎症损伤和凋亡。我们发现一个新的circRNA,circ＿0008082,阐明了其在脓毒性休克心功能障碍中发挥的作用及机制,为其成为脓毒性休克心功能障碍潜在的诊断和治疗靶点提供理论依据。