淋巴瘤是儿童及青少年时期常见的恶性肿瘤，是继白血病和脑肿瘤之后的第三大儿童恶性肿瘤。其中非霍奇金淋巴瘤约占80%。随着环境污染，遗传因素，生物、物理因素等影响的加剧，淋巴瘤新发率有逐年上升趋势。目前联合化疗仍为治疗NHL乃至造血系统恶性肿瘤的主要有效手段，近年来，随着联合化疗方案的不断完善，以及造血干细胞移植、单克隆抗体等高新医学诊断及治疗技术的迅猛发展，淋巴瘤的疗效有了显著提高，5年无事件生存率（EFS）及总生存率（OS）均得到了明显改善。但由于造血系统恶性肿瘤一般发生在血流丰富、易于转移的部位及器官，其复发、转移率较其他恶性肿瘤更为显著。侵袭、转移最终成为除感染外大多数患儿死亡的主要原因，且是目前影响其治疗效果的主要困扰之一。此外，传统化疗药物对患儿正常细胞的毒副作用，可引起机体免疫力下降，严重者可导致重度感染，甚至危及生命。这严重制约了国内外淋巴瘤治疗的发展。因此，寻求理想的治疗药物和有效的联合化疗方案提高其治疗有效率及降低其转移、复发率已成为肿瘤治疗领域亟需解决的问题之一。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（T lymphoma invasion and metastasisinducing factor1，Tiam-1）是鸟苷酸转换因子（guanine nucleotide exchangefactors，GEFs）的家族成员。作为重要的细胞骨架调节因子之一，Tiam-1与恶性肿瘤侵袭、转移密切相关。Tiam-1在体内外特异性的激活RhoGTPase家族中的Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-related C3botulinumtoxin substrata1，Rac1）。Rac-1主要通过调节肌动蛋白的细胞骨架，从而影响细胞形体极化，并抑制细胞凋亡，促进细胞运动与迁移，在肿瘤细胞的侵袭转移中发挥着重要作用。据研究报道，强心苷类药物对多种恶性肿瘤均有抑制作用，其作用机制可能涉及对肿瘤细胞增殖的抑制，凋亡的促进，以及分化的诱导等方面。研究者还发现植物来源的药物如夹竹桃苷、洋地黄毒苷等对恶性肿瘤细胞具有明显的增强放疗作用。但有关地高辛对恶性淋巴瘤细胞侵袭转移的影响及其作用机制，以及淋巴瘤细胞的体外药物敏感率及化疗药物增敏作用报道甚少。第一部分：地高辛对淋巴瘤raji细胞侵袭能力的影响及作用机制的研究目的：1选取确定为非霍奇金淋巴瘤的组织标本为研究对象,结合临床及病理资料对Tiam-1及Rac-1的蛋白表达进行检测和分析；2以人Burkitt淋巴瘤raji细胞为研究对象，观察不同浓度地高辛对其侵袭转移能力的影响，检测侵袭转移因子Tiam-1及Rac-1的表达。对强心苷类药物抑制恶性淋巴瘤细胞侵袭转移能力进行初步探讨。方法：1采用免疫组化S-P方法，根据抗原抗体反应原理，检测非霍奇金淋巴瘤Tiam-1及Rac-1蛋白表情况；2体外培养人Burkitt淋巴瘤raji细胞并用不同浓度地高辛进行干预，通过细胞侵袭实验，以及实时荧光定量PCR技术检测细胞中Tiam-1、Rac-1表达水平，观察不同浓度地高辛对raji细胞侵袭能力的影响。结果：1免疫组化结果显示：①30例非霍奇金淋巴瘤组织中，Tiam-1蛋白染色有21例为阳性（70%）；10例正常淋巴结组织中Tiam-1蛋白染色有2例阳性；两者之间的差异性有显著性（P＜0.05）。Rac-1蛋白染色有22例为阳性（73.33%），其阳性表达情况显著高于正常组织的阳性表达（1/0%）；两者差异有显著性（P＜0.01）。②参照国际预后指数分型标准，9例高、中危的非霍奇金淋巴瘤Tiam-1表达均为阳性，低、中低危21例中，有12例阳性，阳性率为57.14%。统计学分析显示两组件有显著性差异（P＜0.05）。Rac-1在高、中高危的非霍奇金淋巴瘤中表达亦均为阳性，低、中低危的21例中，有13例为Rac-1阳性，阳性率为61.9%。统计学分析显示两组之间的差异有显著性（P＜0.05）。③Tiam-l阳性组Rac-l阳性率(95.23％)高于阴性组Rac-l阳性率(22.22％)，统计学分析显示两组之间的差异有显著性（P＜0.05），相关系数r=0．757(P＜0.01)。④非霍奇金淋巴瘤Tiam-1与Rac-1表达与年龄、性别、临床分期、病理类型均无明显相关性（P＞0.05）。2细胞侵袭实验结果显示：地高辛浓度为50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L处理raji细胞48h后，与对照组相比，各组的细胞侵袭率均有不同程度下降，且与对照组相比均有统计学差异（P＜0.01）；各浓度组之间的细胞侵袭率亦有统计学差异（P＜0.01）；即在一定的浓度范围内，地高辛随着作用浓度的增加，对raji细胞侵袭率有不同程度的抑制作用。3实时荧光定量PCR结果显示：50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L浓度的地高辛分别作用于raji细胞48h，Tiam-1、Rac-1mRNA的相对表达量均低于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.01）；并随着作用浓度的增加相对表达量降低，具有统计学差异；各浓度组之间Tiam-1及Rac-1的相对表达量具有统计学差异（P＜0.05）。结论：1在非霍奇金淋巴瘤中Tiam-1及Rac-1蛋白的表达明显增高，表明Tiam-1及Rac-1蛋白在非霍奇金淋巴瘤的发生和发展过程中发挥作用。2非霍奇金淋巴瘤患者的国际预后指数越高，Tiam-1及Rac-1表达程度越强，考虑Tiam-1及Rac-1与非霍奇金淋巴瘤的危险程度相关3在非霍奇金淋巴瘤中Tiam-1及Rac-1蛋白的表达呈正相关，表明Tiam-1及Rac-1之间可能存在调控影响和作用机制，在非霍奇金淋巴瘤的发生、发展以及侵袭、转移过程中，两者起协同作用。4强心苷类药物地高辛体外对Burkitt’s淋巴瘤raji细胞侵袭转移能力具有明显的抑制作用，且在50-200nmol/L浓度范围内呈剂量依赖性。5地高辛在抑制Burkitt’s淋巴瘤raji细胞侵袭转移能力同时，可使raji细胞中Tiam-1，Rac-1mRNA表达减少，且呈明显的剂量依赖关系。认为地高辛可能通过降低Burkitt淋巴瘤Tiam-1、Rac-1因子表达水平来实现对其侵袭能力的抑制作用。这可能是地高辛抗肿瘤作用新的机制。第二部分：地高辛对非霍奇金淋巴瘤细胞体外药物敏感性的研究目的：本实验通过体外培养非霍奇金淋巴瘤患儿的组织细胞，对地高辛体外药物敏感度进行探索，并研究地高辛联合阿糖胞苷抑制非霍奇金淋巴瘤细胞体外增殖及促进凋亡等效果。方法：体外培养患儿非霍奇金淋巴瘤细胞，给予不同浓度地高辛进行干预，并进一步观察地高辛联合阿糖胞苷的协调作用，应用MTS比色法检测细胞的生长及凋亡状况。结果：1地高辛对非霍奇金淋巴瘤细胞的体外药物敏感度:①浓度为25nmol/L,50nmol/L，100nmol/L，200nmol/L地高辛分别作用于12组非霍奇金淋巴瘤细胞24、48、72h后，各组抑制率均有不同程度增高，其中25nmol/L地高辛组作用敏感度较差。200nmol/L地高辛作用72h敏感度最高；②不同浓度组地高辛作用于非霍奇金淋巴瘤细胞不同时间段，细胞平均抑制率呈不同程度的上升趋势。但各浓度组地高辛作用24h及48h时对敏感率影响的差异不显著，72h不同浓度地高辛作用于非霍奇金淋巴瘤细胞对敏感率的影响有显著性意义（P＜0.05）。表明不同浓度地高辛对非霍奇金淋巴瘤组织细胞的作用敏感率随时间变化有差异性。③通过非霍奇金淋巴瘤细胞作用72h作用后，对不同地高辛浓度组之间的作用差异进行两两比较，仅25nmol/L与200nmol/L药物浓度组对非霍奇金淋巴瘤细胞的作用差异有统计学意义（P＜0.05），余均无显著性差异（P＞0.05）。推断地高辛较高的药物浓度对非霍奇金淋巴瘤细胞的抑制作用更为明显。2不同浓度地高辛对阿糖胞苷化疗效果的协同作用：①地高辛与阿糖胞苷作用于非霍奇金淋巴瘤细胞48h后，平均抑制率均随着两者剂量增加而增强，存在剂量依赖关系。通过对地高辛及阿糖胞苷联合作用进行析因设计的方差分析，不同浓度的地高辛作用于非霍奇金淋巴瘤细胞有显著性差异（F地高辛=20.567，P＜0.01），各浓度组的阿糖胞苷作用于非霍奇金淋巴瘤细胞亦有显著性差异（F阿糖胞苷=57.182，P＜0.01）。阿糖胞苷与地高辛之间存在交互作用（F交互=4.252，P＝0.001）。且两者具有一定协同作用（见Fig.8，Table12）。②单独效应方差结果分析显示：阿糖胞苷的单独效应均有统计学意义。但阿糖胞苷药物浓度为20μmol/L及50μmol/L时，不同浓度组地高辛对非霍奇金淋巴瘤细胞的药物作用无显著性差异。阿糖胞苷药物浓度为100μmol/L时，各组药物浓度的地高辛对非霍奇金淋巴瘤细胞的作用的差异具有显著的统计学意义（F=24.390，P＜0.01）。故考虑较高浓度阿糖胞苷作用于淋巴瘤细胞时，地高辛对阿糖胞苷的协同作用更为明显。结论：1强心苷类药物地高辛可通过调节Tiam-1及Rac-1因子的表达对淋巴瘤侵袭及转移起到一定抑制作用。2强心苷类药物地高辛在体外可对非霍奇金淋巴瘤细胞有一定抑制作用，且对阿糖胞苷的化疗效果有一定增强，在阿糖胞苷高浓度时协同作用效果更为明显。但就敏感性而言，个体之间可能有一定差异性。