论文部分内容阅读
目的:脑出血是一种具有高发病率、高致残率及高死亡率的脑血管病类型,严重威胁人类健康,给家庭和社会带来沉重的负担。脑出血对于脑细胞的损伤包括原发性的血肿压迫造成的损伤和继发的由于血肿分解产物毒性作用导致的损伤。研究表明脑出血后继发性损伤是影响脑出血患者预后的关键因素。脑出血继发性损伤的机制很复杂,包括局部氧化自由基释放、急性炎症反应、血肿周围的水肿效应、凋亡、自噬等。目前脑出血的治疗方法有限,选择性针对脑出血后血肿灶周组织缺血缺氧、水肿、凋亡等病理生理过程的治疗研究颇为重要。微小RNA（micro RNA,miR）是一种不同物种之间高度保守的长度约为18-25个核苷酸的单链非编码短序列RNA。micro RNA可以通过抑制信使RNA（messenger RNA,m RNA）的翻译过程或者促进m RNA的降解来参与转录后基因表达调控。前期研究表明miR-26a在脑出血患者的血清中显著降低,考虑其参与了脑出血的病理生理过程。miR-26a的表达失调参与了抵御病原微生物入侵的天然免疫应答、器官组织的发育分化、凋亡以及多种实体肿瘤和造血系统恶性肿瘤的发展、抑制等生物学过程。本研究旨在评估miR-26a-5p对模拟脑出血环境下生长的PC12细胞的神经保护作用及对胶原酶诱导的脑出血大鼠模型脑损伤的潜在治疗效果,并研究其可能的机制。研究方法:1、造脑出血大鼠模型:选取雄性8–10周龄,体重250-300 g的SD大鼠8只,应用脑立体定位仪,通过微量输注泵将胶原酶VII注入右侧纹状体。2、Real Time PCR检测脑出血大鼠双侧脑组织miR-26a-5p含量:脑出血模型制作24 h后处死大鼠,取出血侧以及对侧相应部位的脑组织做Real Time PCR,对比两侧miR-26a-5p表达是否存在差异;3、Real Time PCR检测与凋亡信号通路相关的PPAR-γ、SOX6、PTEN、SENP1、MAPK6、AQP4及SMAD1基因在脑出血大鼠双侧脑组织含量,并进行对比。4、造脑出血大鼠模型并分组:选取雄性8–10周龄,体重250-300 g的SD大鼠,分为7组,每组8只,分别为正常组、假手术组、模型组、模拟物（mimic）阴性对照组、抑制物（inhibitor）阴性对照组、miR-26a-5p mimic组和miR-26a-5p inhibitor组。空白对照组大鼠正常饲养,假手术组注射生理盐水,其余组大鼠造脑出血模型,同次同部位分别进行相应干预。5、神经损伤严重缺损（m NSS）评分:分别于操作结束后1天、7天和14天对各组大鼠进行神经损伤严重缺损（m NSS）评分。6、Tunel检测神经细胞凋亡:14天评分结束后处死各组大鼠,Tunnel法测定比较脑出血大鼠双侧脑组织神经细胞的凋亡情况。7、western blot:检测对比脑出血大鼠双侧脑组织中与信号通路相关的Akt、p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、SENP1、PTEN、MAPK6、SMAD1和SOX6的表达情况。8、体外脑出血环境模型的构建与分组:将培养的PC12细胞分为五组,分别为未转染组、mimic阴性对照转染组、inhibitor阴性对照转染组、miR-26a-5p mimic转染组、miR-26a-5p inhibitor转染组。应用荧光显微镜观察细胞转染24h后细胞转染效率,Real-Time PCR检测细胞转染24h后miR-26a-5p的表达。用无糖的DMEM培养基加入10u M氯化高铁血红素（Hemin）模拟脑出血环境。将五组处理后的处于对数生长期的PC12细胞置于该培养基内,并设置阴性对照。9、MTT比色法评价细胞存活情况:在培养基中处理4小时后进行MTT比色法检测比较各组PC12细胞存活率。10、tunel法:用tunel法检测比较各组PC12细胞凋亡情况。11 western blot:用western blot检测比较各组与凋亡信号通路相关的Akt、p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、SENP1、PTEN和SOX6的基因表达情况。结果:1、脑出血模型的大鼠中,脑出血侧脑组织的miR-26a-5p的表达量明显降低（p<0.01）。PPAR-γ在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显升高（p<0.01）;SOX6在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显减低（p<0.05）;PTEN在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显减低（p<0.01）;SENP1在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显升高（p<0.05）;MAPK6在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显升高（p<0.01）;AQP4在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显升高（p<0.01）;SMAD1在大鼠脑出血侧较未出血侧含量明显减低（p<0.01）。2、脑出血模型大鼠在注射miR-26a-5p mimic后,m NSS评分在1天较mimic阴性对照组无明显差异,7天、14天与对照组相比均明显下降（P<0.01）;而在注射miR-26a-5p inhibitor后,m NSS评分在1天,7天较inhibitor阴性对照组无明显差异,14天较inhibitor对照组明显升高（P<0.05）。3、Tunel法检测:应用miR-26a-5p mimic后较mimic阴性对照组相比,脑出血大鼠神经细胞凋亡数量减少（P<0.01）。4、western blot:miR-26a-5p Mimic组较mimic阴性对照组相比p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ含量明显增加;cleaved caspase-3、Bax、SENP1、SOX6含量明显减少;而miR-26a-5p inhibitor组较inhibitor阴性对照组相比p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ含量明显减少;Bax、SENP1、cleaved caspase-3含量明显增加;两组分别与阴性对照组相比AKT、PTEN、caspase-3和SOX6含量差异没有统计学意义。5、MTT:miR-26a-5p mimic转染组较mimic阴性对照转染组PC12细胞存活数量增加（P<0.01）;而miR-26a-5p inhibitor转染组较inhibitor阴性对照转染组PC12细胞存活数量明显减少（P<0.01）。6、Tunel:miR-26a-5p mimic转染组较mimic阴性对照转染组细胞凋亡比率明显降低（P<0.01）。7、western blot:miR-26a-5p mimic转染组较mimic阴性对照转染组p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ含量明显增加;SOX6、cleaved caspase-3、Bax、SENP1含量明显减少;AKT、caspase-3、SMAD1、MAPK6、PTEN含量差异没有统计学意义;而miR-26a-5p inhibitor转染组较inhibitor阴性对照转染组相比p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ含量明显减少;SOX6、cleaved caspase-3、Bax、SENP1含量明显增加;AKT、caspase-3、SMAD1、PTEN和MAPK6含量差异没有统计学意义。结论:1、脑出血大鼠出血部位脑组织中miR-26a-5p表达量明显下降。2、脑出血大鼠模型在注射miR-26a-5p mimic后较mimic阴性对照组7天、14天神经功能缺损情况明显改善;注射miR-26a-5p inhibitor后14天神经功能缺损情况较inhibitor对照组恶化。3、脑出血大鼠模型在注射miR-26a-5p mimic后,与mimic阴性对照组相比,出血部位神经细胞凋亡比率明显下降。4、miR-26a-5p mimic组较mimic阴性对照组抑制凋亡基因p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ含量明显增加,促凋亡基因cleaved caspase-3、Bax、SENP1、SOX6含量明显减少,相反miR-26a-5p inhibitor转染组较inhibitor阴性对照组p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ含量减少,Bax、SENP1、cleaved caspase-3含量明显增加。说明在体内环境下miR-26a-5p对脑出血大鼠具有神经保护作用,且该作用是通过抗凋亡实现的。5、在模拟脑出血环境下,转染了miR-26a-5p mimic的PC12细胞与mimic阴性对照组相比存活比率增加;而转染了miR-26a-5p inhibitor的PC12细胞与inhibitor阴性对照组相比存活比率下降。6、在模拟脑出血环境下,转染了miR-26a-5p mimic的PC12细胞与mimic阴性对照组相比凋亡比率下降。7、转染了miR-26a-5p mimic的PC12细胞与mimic阴性对照组相比抑制凋亡基因p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ表达增加而促凋亡基因SOX6、cleaved caspase-3、Bax、SENP1表达下降;转染了miR-26a-5p inhibitor的PC12细胞与inhibitor阴性对照组相比抑制凋亡基因p-AKT、Bcl-2、PPAR-γ表达下降,而促凋亡基因SOX6、cleaved caspase-3、Bax、SENP1表达升高。说明在体外环境下miR-26a-5p对脑出血大鼠具有神经保护作用,且该作用是通过抗凋亡实现的。