论文部分内容阅读
目的本课题研究瘦素（leptin）调控乳腺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）交互对话对乳腺癌侵袭转移的影响，并对其相关分子机制进行了探讨。方法：1.用PMA及IL-4处理THP1细胞，将其诱导成M2型巨噬细胞(M2macrophage)，倒置显微镜下观察细胞形态的改变，并用流式细胞术检测其分子表型（CD206、IL-10、IL-12及TGF-β）的改变。2.qRT-PCR及Western bloting法检测leptin作用的M2型巨噬细胞分泌的关键因子及其水平。3.免疫荧光分析、qRT-PCR及Western bloting法检测leptin作用下M2型巨噬细胞中Ob-R的表达水平。4.划痕试验和Transwell侵袭试验检测IL-8对乳腺癌MCF7、MDA-MB-231细胞迁移及侵袭的影响；用IL-8抗体中和leptin处理的M2型巨噬细胞-乳腺癌细胞共培养系统中的IL-8后，检测乳腺癌细胞迁移侵袭的变化情况。5.采用qRT-PCR及Western bloting，用常用信号通路抑制剂处理，检测leptin作用M2型巨噬细胞分泌IL-8的相关信号通路（MAPK/ERK1/2和p38MAPK），并进一步验证这些通路的激活是通过leptin-ObR轴而启动。6.免疫组织化学染色（IHC）检测人乳腺癌样本中CD68，Ob-R及IL-8的表达情况。7.取6-8周Babl/c雌性裸鼠，在近右下肢乳腺脂肪垫处移植MDA-MB-231细胞，建立裸鼠乳腺癌移植模型；腹腔内注射Clophosome-Clodronate Liposomes耗竭小鼠体内的巨噬细胞后，待肿瘤长至一定大小，瘤内注射leptin，观察肿瘤的生长情况、生存期及肿瘤肝肺转移情况；免疫组织化学染色检测肿瘤CD68，Ob-R及IL-8的表达情况。结果：1.采用PMA及IL-4将THP1诱导成M2型巨噬细胞，细胞由悬浮状态变为贴壁状态，且少数细胞伸出伪足；流式细胞术检测发现M2型巨噬细胞表面标志CD206为阳性，且与THP1相比，其IL-10及TGF-β为高表达，而IL-12为低表达。2. Leptin作用使M2型巨噬细胞IL-8表达明显升高，且IL-8能促进乳腺癌MCF7及MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭，而中和了M2型巨噬细胞-乳腺癌细胞共培养系统中的IL-8后，乳腺癌细胞的迁移及侵袭被明显抑制。3.THP1及M2型巨噬细胞均表达Ob-R，且leptin作用下M2型巨噬细胞的Ob-R表达升高；Leptin能与Ob-R结合，激活M2型巨噬细胞MAPK/ERK1/2和p38MAPK信号通路，关键分子p-ERK1/2及p-p38表达明显升高，从而促进IL-8表达升高。4.在人转移性乳腺癌样本中，CD68、Ob-R及IL-8的表达显著高于在良性乳腺样本和原位乳腺癌样本中。5.在裸鼠乳腺癌移植模型中，leptin不仅促进乳腺肿瘤的生长和降低小鼠的生存期，而且肿瘤的肺转移可能与leptin促进TAMs分泌IL-8有关。结论：1.Leptin通过leptin-Ob-R轴，激活M2型巨噬细胞的MAPK/ERK1/2和p38MAPK信号通路，从而促进TAMs IL-8表达升高；leptin通过调控TAMs分泌IL-8，影响TAMs-乳腺癌细胞交互对话，从而促进乳腺癌的迁移及侵袭。2.在人转移性乳腺癌样本中，TAMs的数量、Ob-R及IL-8的表达显著高于良性乳腺样本和原位乳腺癌样本。3.在荷瘤裸鼠体内，leptin促进乳腺肿瘤的生长和降低小鼠的生存期。而且肿瘤的肺转移可能与leptin促进TAMs分泌IL-8有关。