论文部分内容阅读
研究背景
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在与癌症相关的死亡中，胃癌致死率居于第二位。胃癌的发生是一个多因素交叉、多步骤渐进的过程。其中，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染与胃癌的发生之间关系密切，1994年世界卫生组织已将其正式列为Ⅰ类致癌因子。研究显示在慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生至胃癌的演变过程中，幽门螺杆菌可能作为一个先导性的始动因素参与到胃癌的早期事件。幽门螺杆菌及其毒力因子CagA参与到幽门螺杆菌感染所导致的病理过程中，但涉及的分子机制尚未明了，仍需大量的科学研究来进一步探索。
近年来的研究证明，感染、炎症与一些肿瘤的发生有着密切的关系。胃癌发生的一个重要原因是基于幽门螺杆菌感染所诱发的慢性胃炎的形成。炎症恶性转化的调控网络是由众多基因、非编码RNA、蛋白质和代谢分子所构成的。其中，叉头蛋白M1(Forkhead Box M1，FoxM1)是细胞周期相关正调控转录因子，其促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，调控下游细胞周期相关蛋白的表达，广泛参与到多种癌症的发生和发展过程中。microRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度约为18-24个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶基因3UTR的完全或不完全配对，进而降解靶基因信使RNA（mRNA）或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。miRNA在肿瘤细胞和肿瘤组织中异常表达，可以作为原癌基因或者抑癌基因，与肿瘤的发生发展关系密切。已经证实FoxM1和miRNAs在癌细胞及癌组织中异常表达，影响癌症的发生、发展及预后等，然而FoxM1及miRNAs在幽门螺杆菌相关胃癌发生的具体作用机制仍有待于进一步研究。
研究目的
本课题组以往的研究发现，增殖相关细胞周期转录因子FoxM1通过调控下游细胞周期相关蛋白P27kip1在胃癌发生中发挥作用。在此基础上，本研究的目的是探讨FoxM1幽门螺杆菌感染所致的慢性炎症到癌症的恶性转化中相关分子机制，为寻求新的胃癌防治生物靶标提供理论依据。
方法和结果
1.FoxM1在幽门螺杆菌感染胃部组织标本中的表达分析:通过实时定量PCR(Real-time PCR)及免疫组织化学(IHC)检测，在幽门螺杆菌感染阳性的癌旁正常组织、浅表性胃炎、萎缩性胃炎伴肠化生及胃癌组织病例标本中，FoxM1在肿瘤早期的炎性阶段已经被显著活化，并随着病程的深入表达逐渐升高。
2.体外分析幽门螺杆菌及其毒力因子CagA调控FoxM1对胃癌细胞增殖的影响:通过Real-time PCR及western blot检测，在多种胃癌细胞株中均存在FoxM1的表达，并且幽门螺杆菌感染可以时间依赖性和剂量依赖性地活化FoxM1。当用幽门螺杆菌的不同组分处理胃癌细胞株时，毒力因子CagA在调控FoxM1的表达中发挥重要作用，同时，利用CagA质粒转染细胞也得到相似的结果。利用幽门螺杆菌感染或者CagA质粒转染胃癌细胞株均能够降低P27kip1mRNA以及蛋白水平的表达，同时抑制P27kip1启动子的活性，并且可以显著增强细胞的克隆形成能力，提示二者能够促进肿瘤细胞增殖。
3.预测鉴定FoxM1是miR-370的直接靶基因并检测FoxM与miR-370在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性:分析miR-370调控FoxM1在幽门螺杆菌对胃癌细胞增殖中的影响，microRNA芯片筛查及生物信息学软件预测均提示miR-370可靶向作用于FoxM1。组织标本中，Real-time PCR检测表明在炎症向癌症转化的过程中miR-370表达呈下降趋势，与FoxM1的表达呈现负相关关系。细胞实验中，利用miR-370的表达质粒转染细胞可以显著抑制FoxM1的表达，同时双荧光素酶报告基因检测表明FoxM1是miR-370的直接靶基因。幽门螺杆菌及CagA可显著下调miR-370的表达，并且miR-370介导了幽门螺杆菌及CagA对FoxM1的调控。利用细胞克隆形成实验表明miR-370在幽门螺杆菌诱发的细胞增殖中起负调控的作用。
4.体内分析miR-370-FoxM1在幽门螺杆菌感染所致慢性炎症中的作用:利用幽门螺杆菌标准菌株SS1进行小鼠灌胃造模，结果表明幽门螺杆菌的长期感染和定植可以触发慢性胃炎的发生，但是，单纯的幽门螺杆菌感染难以诱发小鼠胃癌的发生。在幽门螺杆菌所造成的慢性胃炎中，miR-370的表达是下调的，与之相对的是FoxM1表达的升高。
结论
1.组织标本检测中，FoxM1的表达升高不仅发生在胃部肿瘤组织中，也发生在胃炎标本中，FoxM1的异常表达是一个早期事件，提示其在恶性转化中的作用，是肿瘤发生的原因而非结果。
2.幽门螺杆菌感染胃癌上皮细胞可以诱发FoxM1表达的上调，其中起主要作用的是其毒力因子CagA。
3.幽门螺杆及其毒力因子CagA参与胃癌细胞的增殖，机制在于通过上调FoxM1从而抑制P27kip1的表达和启动子活性。
4.miR-370直接靶向作用于FoxM1，并且miR-370-FoxM1信号途径参与到幽门螺杆菌诱导的细胞增殖。
5.动物实验表明幽门螺杆菌可以引起胃炎的发生，而miR-370调控FoxM1参与其中。