肿瘤靶向治疗是目前抗肿瘤研究的热点，其旨在提高药物对肿瘤组织的靶向杀伤活性，且降低对正常组织的毒性，做到真正的高效低毒。目前的肿瘤靶向药物中，酪氨酸激酶及丝苏氨酸激酶抑制剂是其中的重点，目前已有多种药物上市，且在临床上获得较好的治疗效果。但同时，肿瘤耐药是目前靶向治疗的一大障碍。因此，探索肿瘤靶向药物耐药的分子机制以寻求克服其耐药的治疗策略无疑意义重大。在本研究中，我们重点关注了靶向酪氨酸激酶HER2的抗体药物偶联物T-DM1在HER2阳性胃癌中的耐药机制和克服策略。另外，我们发现靶向丝苏氨酸激酶BRAF的小分子药物dabrafenib与sorafenib合用于BRAF V600E突变的结肠癌中产生明显的拮抗作用，因此，本研究也将对此拮抗作用的分子机制进行研究。　　第一部分是关于T-DM1的耐药机制研究。T-DM1是将靶向HER2的曲妥珠单抗(trastuzumab)和靶向微管的细胞毒药物mertansine(DM1)通过蛋白酶不可剪切链(SMCC)连接起来的新型抗体-药物偶联物(Antibody-drug conjugate，ADC)。与单纯的trastuzumab和DM1的联用相比，T-DM1利用了trastuzumab与HER2结合的靶向作用，把DM1直接带至肿瘤组织，从而极大避免了DM1对正常组织的杀伤，也就明显降低了毒副作用，并极大增强DM1对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。T-DM1是第一个被美国食品与药品监督管理局(Food and Drug Administration;FDA)批准用于临床的靶向HER2的抗体-药物偶联物。不幸的是，虽然T-DM1在临床研究中疗效很好，但多数病人用T-DM1治疗后最终会失去疗效而复发，还有些HER2阳性患者最初对T-DM1不敏感，归根到底，是产生了对T-DM1的耐药。目前关于T-DM1的耐药机制报道的相对较少，其确切耐药机制还不明确，因此，深入研究T-DM1的耐药机制对于更深入研究其作用机制以及克服其耐药并提供相应的治疗手段无疑意义重大。在前期的工作中，我们在高表达HER2的人胃癌N87细胞中通过T-DM1缓慢诱导的方式，逐步提高T-DM1浓度，最终挑选、获得了多株耐药细胞株。在本研究中，我们以N87-16-8为例，深入研究了T-DM1耐药株的耐药机制，并在体内外探索出适合的耐药性克服策略。　　通过实验研究，我们发现:耐药株N87-16-8对T-DM1有着约53倍的耐药性，对trastuzumab和DM1以及其他HER2靶向药物、微管抑制剂的敏感性与N87细胞相比并无明显区别，体现了N87-16-8对T-DM1耐药的选择性，同时提示T-DM1耐药株N87-16-8的耐药机制可能不同于已报道的HER2靶向药物或是微管抑制剂的耐药机制。N87-16-8中HER2的表达量较N87细胞相当，能显著影响T-DM1活性的关键环节如T-DM1与HER2的结合、T-DM1-HER2复合物的内吞和重循环回细胞膜等在N87-16-8及N87细胞间均无区别。不同的是，T-DM1显著诱导N87细胞中微管的解聚，但对N87-16-8细胞中的微管无明显作用。进一步的研究表明，T-DM1在细胞内的活性代谢产物lysine-MCC-DM1产量在耐药株N87-16-8中较N87细胞中显著降低是T-DM1无法诱导N87-16-8细胞中微管解聚的原因。若将Ⅴ-ATPase选择性抑制剂Baf-Al与T-DM1合用于N87细胞，可发现胞内溶酶体酸化程度下降，lysine-MCC-DM1释放量降低，且N87细胞对T-DM1产生明显耐药性;采用RNAi法干扰掉Ⅴ-ATPase后出现了类似Baf-A1的效果，提示了Ⅴ-ATPase参与了T-DM1在N87细胞中释放出lysine-MCC-DM1这一代谢过程。对N87及N87-16-8细胞中Ⅴ-ATPase总的表达量及富集溶酶体中Ⅴ-ATPase的表达量进行检测，可发现Ⅴ-ATPase表达量在N87-16-8细胞中和富集溶酶体中均明显降低，同时N87-16-8细胞内溶酶体酸化程度显著下降。综合以上结果，我们认为活性代谢物lysine-MCC-DM1释放量的降低是由于T-DM1在溶酶体降解环节失调导致的，原因在于影响溶酶体发挥作用的关键酶Ⅴ-ATPase表达量显著下降。有意思的是，我们发现，另一种通过蛋白酶可剪切链(Val-Cit)链（此种linker可不依赖于溶酶体剪切从而释放出活性的MMAE）接起来的ADC类药物hertuzumab-vc-MMAE能够有效地克服N87-16-8细胞对T-DM1的耐药。并且，在体内实验中，hertuzumab-vc-MMAE也体现出了对T-DM1耐药株耐药性的明显克服活性。这些发现表明，Ⅴ-ATPase活性可以作为带有蛋白酶不可剪切链的ADC类靶向药物临床治疗的逆向标志物。对于那些已经对T-DM1类ADC产生耐药性的肿瘤细胞株，拥有蛋白酶可剪切链的ADC类药物如hertuzumab-vc-MMAE不失为一个更好的选择。　　第二部分是关于索拉菲尼(sorafenib)与达拉菲尼(dabrafenib)合用的拮抗机制研究。RAF是MAPK信号通路中的重要节点，作为肿瘤靶向治疗的重要靶点，RAF抑制剂的研发一直是抗肿瘤研究的一大重点。RAF抑制剂主要通过抑制RAF的活性最终导致MEK/ERK1/2信号受到抑制而发挥其抗肿瘤活性。在肿瘤细胞中异常活跃的RAF主要是BRAF和CRAF，其中，靶向突变BRAF V600E的特异性抑制剂dabrafenib（TypeⅠ型抑制剂）已经FDA批准单独或者与MEK抑制剂曲美替尼(trametinib)联合用于治疗伴有BRAF V600突变的不可切除或转移性黑色素瘤;sorafenib（TypeⅡ型抑制剂）作为同时靶向CRAF，野生型BRAF和V599E突变的BRAF，以及VEGFR-2和VEGFR-3等的多靶点抑制剂，已分别于2005年和2007年被FDA批准用于晚期肾癌和肝细胞癌的治疗，并于2013年获批用于治疗晚期放射性碘难治性甲状腺癌。　　我们意外地发现:在野生型与V600E突变型BRAF共存的肿瘤细胞HT-29及Colo205细胞中，sorafenib和dabrafenib合用与dabrafenib单用相比不仅没有产生协同作用，反而产生了明显的拮抗作用，而在只存在野生型BRAF的肿瘤细胞或是只存在突变型BRAF的肿瘤细胞中则无此现象。Sorafenib与dabrafenib合用产生的拮抗作用依赖于野生型与突变型BRAF共同存在，而不依赖于CRAF或是其下游MEK信号。进一步的机制研究表明，只有在野生型与V600E突变型BRAF共同存在的细胞株HT-29及Colo205中，sorafenib才能显著逆转dabrafenib对P-AKT的抑制作用，而采用PI3K/AKT抑制剂GDC0941与两药合用，可显著下调P-AKT表达水平并逆转两药产生的拮抗作用，提示了P-AKT是介导sorafenib及dabrafenib在HT-29及Colo205细胞中合用产生拮抗作用的关键因子。我们的结果表明，与“在癌症病人治疗早期便采用同一靶点的靶向药物联用能获得更好治疗效果”这一观点不同，同样作用于BRAF的sorafenib与dabrafenib并不适合在野生型与突变型BRAF共存的肿瘤细胞中合用，这为临床上联合用药的方案提供了一定的指导。