恶性肿瘤是现代社会人类常见的死亡原因之一。目前,全球每年有1200万人被确诊为癌症,760万人死于癌症,占全球死亡人数的13%。预计全世界癌症死亡人数将继续上升,到2030年将超过1100万。目前应用于恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、放疗、化疗以及免疫治疗等。虽然这些方法对肿瘤有一定的治疗作用,但一方面许多肿瘤患者发现时已是晚期,往往失去了手术治疗的最佳时机。另一方面化疗和放疗具有较大的副作用,所以通过增强机体免疫系统的抗肿瘤作用来杀灭肿瘤细胞,成为肿瘤治疗和免疫学研究的热点。随着对化疗药物不断的深入研究,新的药物以及不同机理的药物的联合应用使肿瘤的化疗不断的发展。化疗主要通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞,但是化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时,也会杀伤机体的正常细胞,导致淋巴细胞减少,抑制免疫系统的功能,使得如何更好的发挥化疗对肿瘤细胞的杀伤,增强其对免疫系统的正向促进作用成为目前肿瘤治疗领域的一个新的问题。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前已知的机体免疫系统中功能最强的专职性抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell,APC),能高效地摄取,加工处理和提成抗原,并能够显著的激活初始型T细胞以启动T细胞免疫应答反应,处于启动、调控和维持免疫应答的中心环节。在受到抗原刺激后,DC经由循环或淋巴系统迁移至二级淋巴器官,并在此将所加工处理的抗原提呈给T细胞,在此过程中,肿瘤细胞表面的免疫原性相关分子的高表达对DC功能的发挥起十分重要的作用。因此,如何增强肿瘤细胞的免疫原性,增强刺激DC的效能,从而诱导出更强的抗肿瘤免疫效应,是提高肿瘤治疗疗效的一个重要途径。FOLFOX方案是目前治疗进展期结肠癌的主要化疗方案,化疗药物奥沙利铂(OXA)与5-氟尿嘧啶(5Fu)是该化疗方案中关键的化疗药物。我们研究所获得了我国SFDA正式批准的第一项树突状治疗性疫苗(抗原刺激的人树突状细胞,Antigen-stimulated dendritic cells, APDC)的Ⅱ期临床批文,并开展了DC为基础的序贯性免疫化疗治疗转移性结肠癌的Ⅱ期临床研究,在已经完成的142例转移性结肠癌的病例研究中,试验组采用OXA~+5Fu联合DC免疫治疗的有效率为45.07%(CR~+PR),而对照组采用OXA~+5Fu治疗的有效率仅为25.35%,两组差异显著(P=0.043),试验组的有效率显著高于对照组,提示以DC为基础的序贯性免疫化疗疗法在转移性结肠癌的治疗效果好于单纯化疗的治疗方式。本研究在已取得的研究结果上进一步探讨化疗药物OXA和5Fu促进结肠癌细胞释放的内源性危险信号分子(Danger-associated molecular patterns, DAMPs),对DC的生物学效应的影响并初步探讨引起该生物学效应的机制。同时通过体内外实验,研究OXA和/或5Fu诱导的结肠癌细胞刺激的DC后引发的抗肿瘤免疫应答的效应。并期望通过这些研究探讨能对化疗与免疫系统的相互作用的研究提供依据和思路。本研究共分三个部分进行第一部分OXA和/或5Fu对结肠癌细胞及其联合治疗对结肠癌患者表达DAMPs的影响肿瘤细胞可以表达多种免疫原性相关分子,对于机体抗肿瘤免疫应答反应的诱导有重要影响。化疗药物对肿瘤细胞的的免疫原性影响,是机体抗肿瘤免疫的一个重要方面,对于患者的预后具有重要的影响。目前的研究认为,化疗药物可以通过多种方式作用于肿瘤细胞,本部分通过研究OXA/5Fu是否可以诱导结肠癌细胞释放内源性危险信号(DAMPs)如热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)分子及人高迁移率组蛋白(High mobility group box1, HMGB1)的释放以及表面钙网织蛋白(Calreticulin, CRT)的表达变化,进而研究该效应在机体抗肿瘤免疫中的作用将人结肠癌细胞SW480(3×10~5/ml/孔)置于24孔板中,分别加入0.5mg的OXA和/或10mg的5Fu,未接受OXA与5Fu处理的细胞作为对照,于0、6、12、18、24小时收集细胞,流式细胞仪检测细胞表面CRT的表达,CRT是一种高度保守的,可溶性蛋白质,正常情况下,主要分布在细胞的内质网腔及核被膜,当细胞发生凋亡时,膜表面CRT分子增多、聚集成簇。结果显示经OXA,5Fu单独作用或联合作用的SW480细胞在作用6小时后表面的CRT的表达开始增加,并随着作用时间的延长而表达增加。两种化疗药联合作用诱导CRT的表达量高于单独药物作用诱导的CRT的表达量(P<0.05),提示OXA和/或5Fu可以诱导结肠癌细胞表达CRT。将人结肠癌细胞SW480和鼠结肠癌细胞CT26(3×10~5/ml/孔)置于24孔板中,分别加入0.5mg的OXA和/或10mg的5Fu,未接受OXA与5Fu处理的细胞作为对照,于6、12、18、24、30、36、42小时后收集细胞上清。ELISA kit检测上清中HSP70,HMGB1分子的分泌量。HSPs是在真核细胞和原核细胞中广泛存在的可溶性应急蛋白,HMGB1存在于所有的有核细胞中,当细胞受到刺激时,细胞内的HSPs和HMGB1表达水平提高,并在细胞内重新分布。结果表明OXA,5Fu单独作用SW480细胞18小时HMGB1分子的表达量增加,并随着作用时间的延长而表达增加,至作用36小时达到高峰并持续;而OXA联合5Fu作用SW480细胞12小时HMGB1分子表达增加,在作用30小时时达到高峰,且明显高于OXA或5Fu单独诱导HMGB1。OXA或5Fu单独诱导CT26细胞12小时HMGB1分子的表达量增加,在作用30小时达到分泌最大值;而两药联合在作用CT26细胞6小时时HMGB1分子的表达量增加,在作用30小时时达到分泌最大值,明显高于单药诱导的HMGB1分子分泌的最大值。这些结果说明OXA和/或5Fu可以诱导结肠癌细胞表达HMGB1分子升高,且两种化疗药联合诱导HMGB1分子表达时间提前,且诱导HMGB1分子最大分泌量高于单药诱导的量。OXA, 5Fu以及两药联合作用SW480细胞或CT26细胞均在作用6小时时HSP70分子表达增加,在作用24小时时达到分泌的最大值,两药联合诱导HSP70分子分泌的最大值明显高于单药诱导的HSP70分子分泌的最大值。这些结果显示OXA和/或5Fu可以诱导结肠癌细胞表达HSP70,HMGB1分子升高,并在作用一定的时间能达到表达的高峰,且两种化疗药联合使用诱导效果强于单独药物作用。随后我们对FOLFOX方案化疗的结肠癌患者血清中DAMPs的表达变化进行研究。观察OXA/5Fu为基础的化疗是否能诱导结肠癌患者体内释放出DAMPs。收集结肠癌患者化疗前及化疗后3至7天的非抗凝外周血,于4°C放置2-4小时,4°C低温条件下2000×g,离心20分钟,分离血清。ELISA方法定量测定血清中HSP70,HMGB1分子水平。结果显示,化疗后患者血清中HSP70,HMGB1分子的含量较之化疗前明显升高(P<0.05),表明化疗能够诱导体内产生高水平的HSP70 ,HMGB1分子。第二部分OXA和/或5Fu诱导的结肠癌细胞对DC生物学效应的影响我们将SW480和CT26细胞(1×10~6/ml)置于培养瓶培养,加入OXA至终浓度0.5mg/ml或/和5Fu至终浓度10mg/ml,30小时收集细胞上清,至于1000 ml PBS(含0.5% Chaps ) 4℃透析,透析后4℃,2000×g ,20分钟至于超滤离心管(10000mwco)中超滤。共分为5组,分别为培养基组(OXA~+5Fu-med),单纯肿瘤细胞上清(SW480/CT26-sup), OXA作用肿瘤细胞上清(OXA-sup), 5Fu作用肿瘤细胞上清(5Fu-sup),OXA和5Fu联合作用肿瘤细胞上清(OXA~+ 5Fu-sup)。取新鲜分离的健康志愿者抗凝外周血白细胞,通过淋巴分离液(Ficoll-Histopaque 1.077)于室温,400×g,30分钟密度梯度离心,取界面细胞,置于50ml离心管中,用生理盐水悬浮细胞,300×g, 15分钟离心洗细胞一次,200×g, 10分钟离心洗细胞两次,即获得外周血单个核细胞(PBMC)。用RPMI1640培养基悬浮PBMC,按1×10~7细胞/孔铺于六孔板,37℃、5%CO2孵育2小时,吸弃培养上清,用预温的培养基除去非贴壁细胞,即获得贴壁的单核细胞,贴壁细胞在含人重组GM-CSF(500U/ml)和人重组IL-4(10ng/ml)的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,37℃、5%CO2进行培养。将制备的浓缩上清与培养至第5天的DC共孵育48小时,DC以5×10~5细胞/ml/孔铺入24孔板,TLR4抑制剂作用一小时或不作用后再分别与各组浓缩上清共孵育。孵育48小时候收集细胞和上清。流式细胞仪检测DC的表型, OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup与SW480-sup相比,DC表面CD40, CD86, HLA-DR均明显上调(P<0.05),但是在加入TLR4抑制剂HAT125组的DC却发现各组均不能诱导DC表型的成熟。用LPS处理的DC也观察到与此相一致的结果,说明OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup相对于SW480-sup可以促进DC的表型成熟,且此作用是通过DC表面TLR4受体起作用的。应用ELISA方法测定上清中的炎性因子TNF-α, IL-1β, IL-6和趋化因子MIP-1α, MIP-1β, RANTES和IP-10的含量,结果表明OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup相对于与SW480-sup均能够诱导DC分泌高水平的炎性因子TNF-α, IL-1β, IL-6(P<0.05)。OXA-sup和5Fu-sup相对于SW480-sup只能诱导MIP-1β表达增加,而对其它趋化因子的表达与SW480-sup诱导DC表达的量无明显差异。而OXA ~+5Fu-sup与SW480-sup相比,可以诱导DC产生高水平的MIP-1α, MIP-1β, RANTES和IP-10(P<0.05),而在加入TLR4抑制剂HAT125组的DC各刺激组均不能诱导DC分泌炎性因子和趋化因子。说明OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup相对于SW480-sup可以诱导DC分泌高水平的炎性因子,OXA~+5Fu-sup相对于与SW480-sup能够诱导DC分泌高水平的趋化因子,且此作用需通过DC表面的TLR4受体起作用的。OXA~+5Fu-sup相比与OXA-sup和5Fu-sup具有更强的诱导趋化因子MIP-1α, MIP-1β, RANTES和IP-10的能力,说明OXA~+5Fu-sup具有更强的诱导抗原提呈细胞的能力,进而能够诱导更强的免疫反应。将各刺激组与培养至第5天的DC共孵育48小时,用作混合淋巴细胞反应(MLR)的刺激细胞,以观察DC诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力。经磁珠分选纯化的同种异体的CD4~+T细胞标记CFSE后作为反应细胞,以1×10~4 DC与1×10~5 CFSE标记的CD4~+T细胞共培养96孔板中,5天后收集细胞,流式检测CD4~+T细胞CFSE稀释的比例。结果表明OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup相对于SW480-sup刺激的DC更能诱导同种异体T淋巴细胞的增殖,且这种差异并不体现加入TLR4抑制剂组的DC。结果表明OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup相对于SW480-sup更具有诱导DC成熟的能力,且通过TLR4受体介导此功能。将培养至第六天的健康志愿者DC经TLR4抑制剂作用一小时或不作用,再分别加入各组浓缩的上清刺激4小时后与同体的T细胞按1:10的比例共培养,每隔三天半量换液一次,每隔7天进行一轮刺激,共经两轮刺激,末次刺激后7天收集T细胞作为效应细胞,IFN-γELISPOT法进行特异性T细胞检测。结果发现,OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup相对于SW480-sup,刺激的DC能诱导更多数量的IFN-γ分泌细胞(P<0.05),而经TLR4抑制剂作用过的DC经以上各组刺激却不能诱导特异性T细胞。同样的,我们还证明了OXA-sup,5Fu-sup,OXA~+5Fu-sup能够促进野生型小鼠BMDC表型和功能上的成熟,诱导促炎性因子的分泌和趋化因子的表达,进而诱导特异性的T细胞应答,而不能诱导TLR4缺陷型小鼠来源的BMDC的成熟及诱导促炎性因子的分泌和趋化因子的表达,也能刺激TLR4缺陷型小鼠来源的BMDC诱导特异性的细胞免疫应答。第三部分OXA和/或5Fu诱导的结肠癌细胞刺激的DC在体内诱导的抗肿瘤效应本部分,我们主要研究OXA和5Fu作用的结肠癌细胞刺激的DC在体内诱导的抗肿瘤保护效应和治疗效应。取4至6周的Balb/c小鼠,以颈椎脱位法处死,无菌取股骨,无血清RPMI-1640培养基冲洗出骨髓细胞,280×g,5分钟离心吸弃培养基上清,洗两遍,以1×10~6细胞/孔加入24孔板培养,加10ng/ml mGM-CSF、1ng/ml mIL-4,培养3天后,吸弃培养基及悬浮细胞,重新加入新鲜RPMI-1640完全培养基及mGM-CSF、mIL-4,继续培养3天后,吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体,收集后置新培养瓶培养,3天后收集悬浮细胞即为富集的骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)。将各组上清分别与培养第5天BMDC作用四小时后收集细胞,5×10~5/只皮下免疫同系小鼠,每周免疫一次,共免疫三次。末次免疫后的7天取各免疫组小鼠的脾细胞,采用IFN-γELISPOT法进行特异性的T细胞检测。结果显示经OXA-sup-BMDC,5Fu-sup-BMDC,OXA+5Fu-sup-BMDC免疫小鼠的脾细胞中IFN-γ分泌细胞的数量明显多于CT26-sup-BMDC免疫小鼠的脾细胞中IFN-γ分泌细胞的数量。同时采用流式标记技术检测免疫产生的CTL对靶细胞的杀伤情况,发现经OXA-sup-BMDC,5Fu-sup-BMDC,OXA+5Fu-sup-BMDC免疫小鼠的脾细胞相对于对照组能更加显著的杀伤CT26细胞(P<0.05)。表明经OXA和/或5Fu作用过的结肠癌细胞刺激的DC能够诱导抗肿瘤特异性细胞免疫。我们首先观察了OXA和5Fu作用的结肠癌细胞刺激的DC在体内诱导的抗肿瘤保护效应,末次免疫后7天与小鼠的皮下接种CT-26小鼠结肠癌细胞(2×10~5/只),每隔两天用游标卡尺测量记录荷瘤小鼠的肿瘤大小,观察各组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况及生存期,结果显示OXA+5Fu-sup-BMDC和OXA-sup-BMDC免疫小鼠肿瘤生长的速度明显慢于CT26-sup-BMDC免疫组(P<0.05),5Fu-sup-BMDC免疫小鼠与CT26-sup-BMDC免疫组对肿瘤的生长没有明显的抑制作用。观察至90天,OXA+5Fu-sup-BMDC免疫组4/8只存活,而其他免疫组的小鼠在60天之内均全部死亡。结果表明OXA+5Fu-sup-BMDC和OXA-sup-BMDC免疫小鼠相对于CT26-sup-BMDC免疫小鼠可以明显延长荷瘤小鼠的生存期(P<0.05),5Fu-sup-BMDC免疫组与CT26-sup-BMDC免疫组对荷瘤小鼠生存时间的影响无明显差异。这些结果提示经OXA联合5Fu作用过的结肠癌细胞刺激的DC能够诱导抗肿瘤免疫,抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。这就表明OXA+5Fu-sup-BMDC和OXA-sup-BMDC在一定程度上起到预防肿瘤生长的作用。提示化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时能够增强肿瘤细胞的免疫原性,增强抗肿瘤的免疫应答,延长荷瘤小鼠的生存期。随后,我们观察了OXA和5Fu作用的结肠癌细胞刺激的DC在体内诱导的抗肿瘤的治疗效应。我们预先皮下接种CT26肿瘤细胞,剂量为2×105细胞/只,于接种后三天开始皮下注射上述各组作用的上清刺激的BMDC进行治疗,每隔7天注射一次,共三次。记录各组小鼠肿瘤出现的时间,观察到肿瘤后,用游标卡尺从两个垂直角度测量肿瘤的直径,观察各组小鼠的存活情况。结果发现OXA-sup-BMDC和OXA+5Fu-sup-BMDC免疫对肿瘤的生长有明显的抑制作用( P<0.05 )。但OXA-sup-BMDC,5Fu-sup-BMDC,OXA+5Fu-sup-BMDC作用的小鼠肿瘤生长的速度与CT26-sup-BMDC治疗组没有明显的差异(P>0.05)。各组荷瘤小鼠在荷瘤后的第52天内全部死亡。OXA-sup-BMDC和OXA+5Fu-sup-BMDC免疫作用可延长小鼠的生存时间(P<0.05)。5Fu-sup-BMDC免疫组与CT26-sup-BMDC免疫组不能延长荷瘤小鼠的生存时间( P>0.05 )。而OXA-sup-BMDC , 5Fu-sup-BMDC ,OXA+5Fu-sup-BMDC与CT26-sup-BMDC相比对荷瘤小鼠没有很明显的治疗疗效(P>0.05)。说明OXA和5Fu诱导结肠癌细胞刺激的DC对已荷瘤的小鼠的肿瘤生长有一定的抑制作用,但相对于单纯的结肠癌细胞刺激的DC对小鼠的结肠癌肿瘤没有明显的抑制作用。综上所述,在体外实验中,通过OXA和/或5Fu作用结肠癌细胞,证明化疗药物OXA与5Fu在一定剂量和作用一定的时间能够增强结肠癌细胞表达DAMPs CRT, HMGB1和HSP70分子。同时还证明了OXA联合5Fu治疗可以诱导临床结肠癌的患者释放HMGB1, HSP70分子。将OXA和/或5Fu作用的肿瘤细胞上清与DC共孵育能够促进DC的成熟,并可诱导DC分泌促炎性细胞因子和趋化因子,而单独的SW480/CT26上清不具有此作用,且此作用是通过DC表面的TLR4受体介导的。同时,OXA和/或5Fu作用的肿瘤细胞上清刺激的DC能够体外诱导特异性的细胞免疫应答。这些都提示OXA和5Fu作用过的结肠癌细胞能够增强DC的抗原提呈功能。在动物实验中,将OXA和/或5Fu作用于结肠癌细胞刺激的DC免疫同系的小鼠,其脾脏细胞IFN-γ分泌细胞数量明显多于单纯结肠癌细胞刺激的DC免疫小鼠。经体外诱导可产生对CT26细胞特异性的CTL。同时经OXA和/或5Fu作用于结肠癌细胞刺激的DC免疫小鼠对CT26的肿瘤生长有明显的抑制作用,且可以延长荷瘤小鼠的生存时间。在OXA和5Fu作用的结肠癌细胞刺激的DC在体内诱导的抗肿瘤的治疗效应。OXA和5Fu诱导结肠癌细胞刺激的DC对已荷瘤的小鼠的肿瘤生长有一定的抑制作用,并可以延长已荷瘤小鼠的生存时间。但相对于单纯的结肠癌细胞刺激的DC对小鼠的结肠癌肿瘤没有明显的抑制作用。本研究的结果证明了化疗药物OXA和5Fu可以诱导结肠癌细胞危险信号的释放,增强肿瘤细胞的免疫原性,激活抗原提呈细胞,从而诱导更强的抗肿瘤免疫效应。