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目的:肿瘤的侵袭转移不仅与肿瘤细胞自身的异常有关,而且与其所处的微环境密不可分。肿瘤细胞邻近的成纤维细胞是肿瘤微环境中最主要的一种基质细胞,被称为肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)。CAFs与肿瘤细胞的相互对话在肿瘤的进展中发挥着重要作用。我们计划从肿瘤微环境的角度,分析胃癌CAFs分泌的IL-6和高表达的肌球蛋白轻链激酶MLCK介导CAFs和胃癌细胞相互对话,促进胃癌侵袭转移的作用和分子机制。方法:1)从胃癌组织中分离培养原代肿瘤相关成纤维细胞CAFs和癌旁正常成纤维细胞NFs,作为后续研究的基础。2)ELISA检测分析胃癌组织及细胞分泌IL-6的蛋白水平,免疫荧光染色分析IL-6的定位。3)Transwell实验中用CAFs以及外源性IL-6刺激胃癌细胞,观察其迁移能力;Western blot检测胃癌细胞EMT的变化。4)使用IL-6中和抗体封闭CAFs分泌的IL-6,通过Transwell转移实验检测其对胃癌细胞转移,并检测EMT的蛋白水平变化和下游JAK2/STAT3信号通路的活化情况。5)使用JAK2抑制剂AG490抑制IL-6下游信号通路,分析此时CAFs对胃癌细胞的迁移和EMT的作用。6)使用siRNA下调CAFs中IL-6表达水平,或者使用JAK2抑制剂AG490抑制JAK2/STAT3信号通路,观察CAFs促进胃癌细胞形成的小鼠腹膜转移结节数量的变化。7)检测胃癌组织和细胞中MLCK的表达水平,并观察CAFs和NFs中MLCK表达水平和定位。8)使用siRNA降低CAFs中MLCK的表达水平,与胃癌细胞共培养,观察其对胃癌细胞的EMT和侵袭迁移能力的影响。9)下调CAFs中MLCK的表达水平,观察与胃癌细胞株共培养后胃癌细胞中β-catenin的转移和堆积情况。10)观察下调CAFs中MLCK表达后,与胃癌细胞共同接种到小鼠皮下和腹腔时,小鼠皮下瘤的生长状况和腹膜转移结节的形成情况。结果:1)分离培养胃癌肿瘤相关成纤维细胞CAFs及癌旁正常成纤维细胞NFs,CAFs中的Vimentin、α-SMA、FAP等标志物蛋白的表达明显升高。2)IL-6表达水平在胃癌组织中明显高于癌旁正常组织,并与α-SMA共定位,分离培养的CAFs中IL-6的表达水平也明显高于正常NFs和胃癌细胞株。3)用CAFs或外源性IL-6刺激胃癌细胞,增强胃癌细胞的转移能力,并且促进EMT标志物α-catenin,β-catenin,Ncadherin,SLUG,SNAIL以及ZEB2的表达,同时抑制了E-cadherin的表达水平。4)使用IL-6中和抗体封闭CAFs分泌的IL-6,发现CAFs对胃癌细胞的促转移作用受到抑制,N-cadherin和ZEB2的表达降低,E-cadherin的表达升高,p-STAT3和pJAK2的表达明显降低。5)使用JAK2抑制剂AG490抑制JAK2/STAT3通路的活化,发现p-STAT3和p-JAK2明显降低,CAFs对胃癌细胞的促转移作用受到抑制,Ncadherin和ZEB2的表达下降,E-cadherin表达上升。6)下调IL-6表达的CAFs-siIL-6与胃癌细胞共同接种到小鼠腹腔,发现小鼠的腹膜转移结节明显少于对照组CAFssiNC。在腹腔接种模型中,注射AG490的实验组比注射DMSO的对照组,腹膜转移结节明显减少。7)胃癌组织CAFs中MLCK表达显著高于胃癌细胞。CAFs中MLCK的蛋白及mRNA表达水平均高于胃癌细胞及NFs。8)降低CAFs中MLCK的表达后,胃癌细胞侵袭和转移细胞数明显低于对照组CAFs-siNC;CAFs-siMLCK诱导的胃癌细胞,N-cadherin和MMP2的表达低于CAFs-siNC,而E-cadherin表达则明显较高。9)CAFs-siNC上清刺激使胃癌细胞细胞核中β-catenin升高,而在CAFs-siMLCK组中,胞核中变化不明显。Western blot检测发现在细胞核蛋白中β-catenin的蛋白表达明显上升,胞质中的β-catenin则无明显变化。10)将CAFs-siMLCK与胃癌细胞共同接种到小鼠的皮下,胃癌细胞的体内成瘤能力明显低于CAFs-siNC组,在生长速度和成瘤大小方面均受到明显地抑制。CAFs-siMLCK与胃癌细胞共同接种到小鼠腹腔时,小鼠的腹膜转移能力明显降低,其腹膜转移结节数低于对照组。结论:CAFs通过分泌大量IL-6,激活胃癌细胞内JAK2/STAT3信号通路,促进胃癌细胞的EMT和转移;CAFs高表达MLCK促进胃癌细胞的Wnt/β-catenin信号通路的活化,下调CAFs中MLCK的表达能够抑制CAFs对胃癌细胞的侵袭转移的促进作用。