背景Sonic Hedgehog (Shh)是一种分泌性蛋白,在细胞增殖分化,形态建成,轴突导向等方面均具有重要作用。Shh在鸡胚脊索和脊髓底板表达,并向四周扩散,其所形成的浓度梯度控制脊髓背腹轴的形成。并通过结合不同受体吸引或排斥脊髓联合神经元轴突导向,使不同神经元间形成正确的连接,形成复杂的神经网络。研究Shh的功能,有助于更好的理解神经系统发育机制。目的1.研究鸡胚脊髓不同部位联合神经元纤维向对侧喙部与尾部投射的偏好性以及喙部与尾部投射量的比值是否有统计学差异。2.研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对联合神经元轴突向对侧投射的影响。3.研究鸡胚发育过程中转录因子Pax (Paired box) 3、Pax6、Pax7、神经钙黏蛋白(N-Cadherin, N-Cdh)、钙黏蛋白6(Cadherin6, Cdh6)与钙黏蛋白7(Cadherin7, Cdh7)在鸡胚脊髓中的表达模式。4.研究鸡胚发育过程中,Shh在脊髓中超表达后对Pax基因家族Pax3、Pax6与Pax7蛋白表达以及Cdh7 mRNA表达的影响。方法1.在E3时,利用鸡胚脊髓活体电转基因技术将pCAGGS-GFP质粒分别转入鸡胚颈部、前肢、胸部前段、胸部后段和后肢五个部位,E6-E6.5时取GFP阳性胚胎进行Open Book,用ImageJ对投射纤维进行灰度分析,SPSS统计分析联合神经元纤维向对侧喙部与尾部投射的偏好性以及喙部与尾部投射量的比值是否有统计学差异。2.在E2.5-E3时,对照组,利用鸡胚脊髓活体电转基因技术将pCAGGS-GFP质粒转入鸡胚脊髓一侧；实验组则将携带Shh基因的表达质粒pCAGGS-Shh和pCAGGS-GFP质粒共转入鸡胚脊髓一侧,E6时取材切片,荧光免疫组织化学技术检测Shh是否发生超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对联合神经元轴突投射的影响。3.取鸡胚正常发育过程E3-E6、E8和E10时期的脊髓,每个时期至少取3个材料,固定、脱水、包埋、冷冻切片后,荧光免疫组织化学技术研究E4-E6时期Pax3, Pax6以及Pax7蛋白表达情况,并用原位杂交法检测：N-Cdh. Cdh6与Cdh7在鸡胚脊髓发育过程中的时空表达模式。4.在鸡胚E2.5～E3时,实验组,利用鸡胚脊髓活体电转将pCAGGS-Shh和pCAGGS-GFP质粒共转入鸡胚脊髓一侧,对照组则只转入报告基因质粒。E4-E6时分别取材,原位杂交检测Shh是否真正超表达,超表达后研究对Pax3、Pax6、Pax7以及Cdh7的影响。最后用ImageJ软件对对照组及实验组中四种基因在脊髓两侧的表达进行灰度分析,并利用SPSS统计分析对照组和实验组中脊髓两侧Pax3、Pax6、Pax7及Cdh7的表达量是否存在统计学差异。结果1.所研究的鸡胚脊髓的5个部位中,大多数联合神经元轴突穿越底板后均向喙部投射,少数向尾部投射。除颈部与前肢的联合神经元纤维向对侧喙部与尾部投射的比值之间无统计学差异外(P>0.05),五个部位两两之间均存在极显著统计学差异(P<001)。2.在脊髓组织切片水平上,荧光免疫组织化学结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,’超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧。3.荧光免疫组织化学结果表明E4-E6期间,Pax3主要表达于脊髓翼板,生皮肌节,背根以及背根神经节；Pax6主要表达于跨越翼板和基板的脊髓中间部位；Pax7则主要表达于翼板、顶板和生皮肌节。原位杂交结果表明,鸡胚发育早期,Cdh7主要在生皮肌节、底板、基板背部、运动柱、背根和腹根强烈表达,E8-E10,其表达主要集中在灰质区、背根神经节和腹根。4.原位杂交结果表明,利用鸡胚脊髓活体电转基因技术成功建立了Shh超表达模型。免疫荧光和原位杂交结果表明,Shh超表达后,脊髓转染侧与未转染侧相比Pax3、Pax6、Pax7以及Cdh7的表达量均存在极显著差异(P<0.01),这四种基因在脊髓中的表达均被抑制。结论1.鸡胚脊髓不同部位联合神经元轴突向对侧喙部与尾部的投射有差异。2.Shh是一种轴突导向分子,鸡胚脊髓中Shh超表达抑制脊髓联合神经元轴突向对侧投射。3.鸡胚发育过程中,Pax3、Pax6、Pax7、V-Cdh、Cdh6与Cdh7不同的表达模式预示着它们在鸡胚脊髓及其周围组织发育过程中扮演不同角色。4. Pax3、Pax6、Pax7和Cdh7在鸡胚脊髓中的表达均受Shh信号通路调控。