近些年来,越来越多的证据表明小的非编码RNA分子也以一种保守的方式调控发育的关键环节。目前已发现了至少4类调节性的非编码RNA分子,包括microRNAs(miRNAs),short interfering RNAs(siRNA),repeat-associated small interfering RNAs(rasiRNAs)and piwi-interacting RNAs(piRNAs)[62,63]。在这些小分子RNA中,miRNAs是物种进化上最为保守,并且能够在转录后水平调节众多生命过程,包括胚胎发育。 miR-184在果蝇、小鼠、人中具有高度的保守性,在黑腹果蝇D.melanogaster的胚胎、幼虫、成虫中普遍表达,并随着果蝇的发育其表达水平也逐渐升高。有文献报道,果蝇胚胎miR-184的原位杂交提示,miR-184主要表达在果蝇胚胎的中胚层和部分内胚层。 为了研究miR-184在果蝇发育过程中的重要作用,首先我们构建了miR-184的转基因果蝇,显微注射果蝇胚胎得到3株红眼果蝇。然后,我们利用不同组织特异性的Ga14工具果蝇驱动过表达,分析表型,并用非放射性地高辛标记Northern blot检测miR-184过表达。当使用中胚层特异性的24B-Ga14驱动时则出现了有趣的表型,果蝇可以发育到3龄幼虫期,但却不能发育到蛹期,同时与对照相比,三龄幼虫体型也明显变小；而且三龄幼虫的口钩也出现发育异常。据推测可能与蜕皮激素通路有关。为了判断对蜕皮激素通路的影响情况,我们尝试了蜕皮激素喂食试验。结果未能挽救24B-Ga14驱动UAS-miR-184而导致的表型,因此可以断定蜕皮激素的合成和释放途径未受到影响,而应考虑蜕皮激素下游的级联反应途径受到了影响。 其次我们筛选miR-184的突变体果蝇。从Bloomington购买了一株P-element果蝇,并采用local mutagenesis imprecise P-element excision的方法试图获得miR-184的突变体。 同时为了寻找miR-184可能的靶基因,我们尝试在细胞水平筛选miR-184可能的靶基因。为完成这一目的,先是利用两个生物信息学学软件miRanda和Pic Tar,初步圈定了10个基因。之后,构建了pAc-luciferase-3UTR的重组质粒,首先在pAc的空载质粒中连接报告基因luciferase,然后再连接预测靶基因的3UTR,从而获得测序正确的10个3UTR克隆。 把3UTR重组质粒和miR-184共转果蝇S2细胞,并以pAc空载和无关miR作为阴性对照,同时转染β-gal作为内参。通过检测报告基因luciferase的表达水平,来推测mig-184与靶基因3UTR的相互作用情况。结果显示,CG8121、CG6583、CG10217连接的报告基因水平有明显下降,为下一步寻找到miR-184的靶基因提供了可靠的数据。